| 查看: 7394 | 回复: 10 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
琼脂糖凝胶电泳出现严重的拖带
|
||||
最近跑的电泳，胶上会有拖带，空白对照也会有拖带（样品为PCR产物），不知道是哪里出了问题，请教一下高手啊！ 2013.05.04.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有94人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 琼脂糖凝胶电泳跑成这样是什么原因?
已经有8人回复
- 琼脂糖凝胶电泳的Marker为什么会出现“山”字样的条带
已经有6人回复
- 琼脂糖凝胶电泳技术和实验技巧
已经有58人回复
- 琼脂糖凝胶电泳后发现目的条带偏大是什么原因
已经有6人回复
- DNA琼脂糖凝胶电泳
已经有12人回复
- 琼脂糖凝胶电泳怎么看
已经有6人回复
- 琼脂糖凝胶电泳跑成这样是什么原因？
已经有11人回复
- 琼脂糖凝胶电泳时，只有泳道两边发亮，中间没有条带
已经有9人回复
- 琼脂糖凝胶电泳
已经有10人回复
- 琼脂糖凝胶电泳
已经有20人回复
- 琼脂糖凝胶电泳 制胶
已经有6人回复
- 琼脂糖凝胶电泳图求解
已经有13人回复
- 琼脂糖凝胶电泳
已经有11人回复
- 琼脂糖凝胶电泳跑的时间长了是不是就会出现拖尾呀？
已经有10人回复
- 琼脂糖凝胶电泳结果
已经有6人回复
- 琼脂糖凝胶电泳分析
已经有10人回复
- 琼脂糖凝胶电泳图分析
已经有40人回复
- 琼脂糖凝胶电泳，跑的条带有点难看
已经有15人回复
- 琼脂糖凝胶电泳
已经有10人回复
- 琼脂糖凝胶电泳 基本常识
已经有7人回复
- 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物出现杂带
已经有16人回复
- 【求助/交流】关于琼脂糖凝胶电泳
已经有20人回复
- 【求助/交流】琼脂糖凝胶DNA电泳失败
已经有7人回复
- 【求助/交流】请教琼脂糖凝胶电泳问题
已经有18人回复
5楼2013-05-07 11:32:33
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:52:28
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:52:28
|
下面的内容本来是我回答另一贴的，但是回答的文不对题，对你的帖子到可能是切题的，请参考。 你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过低、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关（过多一般是超过25次循环，你只循环5次应该没有问题）。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：首先可以提高镁离子的浓度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次 数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。以上都不行则要重新设计引物。每种调整均可以分梯度进行。 切胶回收一般如果剪切力不大的话，一般不会引起DNA断裂。 另外可能是PCR实验时发生了污染。污染原因： (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 |
2楼2013-05-06 16:42:13
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
|
下面的内容本来是我回答另一贴的，但是回答的文不对题，对你的帖子到可能是切题的，请参考。把错的地方改过来了（与你的问题不对应的半句话去掉了），另外，少做了一些补充。 你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度不合适（有些帖子一味的说Mg2+离子浓度过高会引起非特异性扩增，这是问题的一个方面，Mg2+离子浓度过低也同样会引起非特异性扩增）、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关（过多循环一般是超过25次循环）。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：首先可以提高镁离子的浓度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次 数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。以上都不行则要重新设计引物。每种调整均可以分梯度进行。 切胶回收一般如果剪切力不大的话，一般不会引起DNA断裂。 另外可能是PCR实验时发生了污染。污染原因： (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 |
3楼2013-05-06 16:45:53
stevenshi021
新虫 (小有名气)
- 应助: 61 (初中生)
- 金币: 545.3
- 红花: 5
- 帖子: 276
- 在线: 35.1小时
- 虫号: 2272292
- 注册: 2013-02-03
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:53:03
gyesang: 回帖置顶 2013-05-07 00:53:06
liuxiuaza: 金币+1 2013-05-07 11:29:49
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:53:03
gyesang: 回帖置顶 2013-05-07 00:53:06
liuxiuaza: 金币+1 2013-05-07 11:29:49
|
这个笑脸哭脸带我感觉不是PCR的问题而是电泳本身的问题。解决方法：1胶凝结的时间稍微长一点，或者在跑得时候放入冰箱1min(-20)使得胶彻底的凝结；2电泳过程中使用新的缓冲液且电压低一点一般TBE不要超过120V，TAE不要超过100V，避免电脑过程中产生大量的热，如果电泳时间过长建议冰上进行。因为我们实验室常用的都是低熔点琼脂糖，在温度高于40°的情况下其内部结构就会不稳地。最后的那种弥散带我感觉可能是你的dNTP多了！ 希望对你有用。 |
4楼2013-05-06 23:58:40
