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琼脂糖凝胶电泳出现严重的拖带
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最近跑的电泳，胶上会有拖带，空白对照也会有拖带（样品为PCR产物），不知道是哪里出了问题，请教一下高手啊！ 2013.05.04.jpg |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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下面的内容本来是我回答另一贴的，但是回答的文不对题，对你的帖子到可能是切题的，请参考。把错的地方改过来了（与你的问题不对应的半句话去掉了），另外，少做了一些补充。 你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度不合适（有些帖子一味的说Mg2+离子浓度过高会引起非特异性扩增，这是问题的一个方面，Mg2+离子浓度过低也同样会引起非特异性扩增）、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关（过多循环一般是超过25次循环）。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：首先可以提高镁离子的浓度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次 数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。以上都不行则要重新设计引物。每种调整均可以分梯度进行。 切胶回收一般如果剪切力不大的话，一般不会引起DNA断裂。 另外可能是PCR实验时发生了污染。污染原因： (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 |
3楼2013-05-06 16:45:53
凌波丽
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【答案】应助回帖
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liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:52:28
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-07 00:52:28
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下面的内容本来是我回答另一贴的，但是回答的文不对题，对你的帖子到可能是切题的，请参考。 你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过低、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关（过多一般是超过25次循环，你只循环5次应该没有问题）。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：首先可以提高镁离子的浓度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次 数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。以上都不行则要重新设计引物。每种调整均可以分梯度进行。 切胶回收一般如果剪切力不大的话，一般不会引起DNA断裂。 另外可能是PCR实验时发生了污染。污染原因： (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 |
2楼2013-05-06 16:42:13
stevenshi021
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gyesang: 回帖置顶 2013-05-07 00:53:06
liuxiuaza: 金币+1 2013-05-07 11:29:49
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这个笑脸哭脸带我感觉不是PCR的问题而是电泳本身的问题。解决方法：1胶凝结的时间稍微长一点，或者在跑得时候放入冰箱1min(-20)使得胶彻底的凝结；2电泳过程中使用新的缓冲液且电压低一点一般TBE不要超过120V，TAE不要超过100V，避免电脑过程中产生大量的热，如果电泳时间过长建议冰上进行。因为我们实验室常用的都是低熔点琼脂糖，在温度高于40°的情况下其内部结构就会不稳地。最后的那种弥散带我感觉可能是你的dNTP多了！ 希望对你有用。 |
4楼2013-05-06 23:58:40
5楼2013-05-07 11:32:33
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