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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌DNA提取~
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白话八股

金虫 (正式写手)

[交流] 细菌DNA提取~

自己在提一株细菌的DNA，提出来要去做PCR。
这株菌表面有一层多糖，先用的CTAB法提的，提取了两次，跑电泳几乎没有条带。各位大神帮看下有步骤什么问题，需要怎么改进？O(∩_∩)O谢谢~
操作步骤：
1.将6ml菌液转入10ml离心管中，4000rpm，离心10min，弃上清。
加入500ul TE缓冲液，震荡，使菌体完全溶解，用移液枪将其转入1.5ml PE管中，再加入500ul 溶菌酶溶液（10mg/ml），体系的溶菌酶终浓度为5mg/ml。
37℃保温3h。
2.加入50ul SDS(10%)  37℃保温1h。
3.加入1ml 65℃预热的CTAB溶液和1ml 5M NaCl溶液
将装有CTAB和样品的EP管放入65℃水浴，约1h
4.冷却后，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1=576:24），12000rpm。离心15min
吸上清，装入一新的EP管
5.加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，12000rpm，离心15min
6.吸上清，转入一新的离心管中，加入1/3体积的NaAc（3mol/l）
加入1ml-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃（-80℃，30min）1-2h
12000rpm，10min弃上清
7、向离心管中加入1ml 75%的乙醇，12000rpm，10min弃上清，置于吸水纸上倒置晾干
8、加入TE缓冲液（10-20ul）溶解
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1楼 2013-05-03 17:49:25
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莓林塔

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 白话八股 at 2013-05-04 09:24:13
蛋白酶Ｋ实验室没找到～现在急着做，能不能用中性蛋白酶？...

不知道啊，没用过呢~我也新手一枚~问问你老师呢？？我老师还木有来~~
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6楼2013-05-04 10:17:26
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莓林塔

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
白话八股(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-03 23:15:47
gyesang: 回帖置顶 2013-05-03 23:16:42
溶菌酶之前先加玻璃珠涡旋振荡破壁，破壁1min然后冰浴1min，4个循环差不多了~我有次也是，特别黏的菌，就这么出来的，你试试吧~而且37度保温也可以换成摇床啊，充分接触~还有就是加SDS的时候不加点蛋白酶K么？2.5微升就够了应该~
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4楼2013-05-03 22:25:35
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白话八股

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-05-03 22:25:35
溶菌酶之前先加玻璃珠涡旋振荡破壁，破壁1min然后冰浴1min，4个循环差不多了~我有次也是，特别黏的菌，就这么出来的，你试试吧~而且37度保温也可以换成摇床啊，充分接触~还有就是加SDS的时候不加点蛋白酶K么？2.5微 ...

蛋白酶Ｋ实验室没找到～现在急着做，能不能用中性蛋白酶？
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5楼2013-05-04 09:24:13
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力亮

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
革兰氏阳性菌 用一般的提取基因组的试剂盒应该就可以的！CTAB法貌似也可以的   前几天我也刚做了   不过就是实验步骤稍微有一点不一样。最后一步TE溶解我是时间稍微长一些。但愿能帮上楼主。
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7楼2013-05-04 10:29:57
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