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zhlsmile

铁虫 (小有名气)

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[求助] 双质粒共同转入酵母细胞

求助请问要将两个质粒一次同时转入酿酒酵母细胞需要注意哪些问题呢？我的转不出来具体情况是这样的：
质粒大小分别是10KB和8000bp左右，有各自的选择标记，用醋酸锂转化法，质粒浓度一般用100ng 转入酵母细胞请问这个转入的情况还需要注意哪些或者有更好的办法？谢谢啦

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1楼2013-05-03 15:43:42

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意孤城_

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhlsmile(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-03 18:12:56
gyesang: 回帖置顶 2013-05-03 18:13:00

酵母转化效率受到很多因素的影响，我3个载体共转基本上效率都非常高

AH109单克隆接种于3ml YPDA中30°250r/min过夜摇菌
1:50接种，同样条件摇菌至OD=0.5（约5h）左右
准备质粒混合液体，总质量约8ug,三个质粒的摩尔数比约为1:1:1,总体积50ul,不足的用水补齐（见附件）
准备ssDNA, 6*25=55*3, PCR仪中94°10min,放冰上备用
30°预热液体YPDA培养基
2ml tube收集菌体 3000r/min离心，灭菌水洗两次
900ul水重悬菌体，加100ul 1M LiAc, 颠倒混匀，30°温浴5min，12000r/min 5s,收集菌体，弃除干净上清
用50ul的质粒混合液轻轻重悬菌体，加入36ul 1M LiAc 和25ul 变性处理后冰上保存的ssDNA,轻轻混匀后加入240ul 50%PEG6000，适当vortex混匀
42°水浴热击45min，30°培养箱预热SD平板
12000r/min 2min, 尽量弃除干净上清，加1ml YPDA(30°预热)/2ml tube, 手摇混匀
30°，200r/min 复苏1-2h
5000r/min 离心4min, 尽量弃除干净上清，加100ul灭菌水，重悬，吹吸混匀
涂板，30°培养3-4d，观察，照相

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2楼2013-05-03 16:35:07

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咭呀嘎

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhlsmile: 金币+1, 鼓励鼓励 2013-05-04 16:24:42
zhlsmile(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:25:03

我有做过双质粒共转酵母的实验，用的也是LiAc和PEG的方法，最后是用两种抗性筛选的。但是涂板之后，板上基本不长。猜想是因为共转效率比较低，而且是两种抗性筛选。所以我在涂板的同时还会同时取转化后的菌液进行摇菌，在含有两种抗生素的液体培养基培养后，再平板划线就可以得到单菌落，最后进行鉴定。希望能帮到你。

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3楼2013-05-03 19:10:06

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zhlsmile

铁虫 (小有名气)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 咭呀嘎 at 2013-05-03 19:10:06
我有做过双质粒共转酵母的实验，用的也是LiAc和PEG的方法，最后是用两种抗性筛选的。但是涂板之后，板上基本不长。猜想是因为共转效率比较低，而且是两种抗性筛选。所以我在涂板的同时还会同时取转化后的菌液进行摇 ...

用液体摇再涂板的话长出来的单克隆有很大可能出自于同一个细胞如果想选几个单克隆验证的话很可能选到同一个对吧？

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4楼2013-05-04 16:27:24

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