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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双质粒共同转入酵母细胞
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zhlsmile

铁虫 (小有名气)

[求助] 双质粒共同转入酵母细胞

求助 请问要将两个质粒一次同时转入酿酒酵母细胞 需要注意哪些问题呢？ 我的转不出来 具体情况是这样的：
质粒大小分别是10KB和8000bp左右，有各自的选择标记，用醋酸锂转化法，质粒浓度一般用100ng 转入酵母细胞 请问这个转入的情况还需要注意哪些 或者有更好的办法？ 谢谢啦
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1楼 2013-05-03 15:43:42
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhlsmile(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-03 18:12:56
gyesang: 回帖置顶 2013-05-03 18:13:00
酵母转化效率受到很多因素的影响，我3个载体共转基本上效率都非常高

AH109单克隆接种于3ml YPDA中30°250r/min过夜摇菌
1:50接种，同样条件摇菌至OD=0.5（约5h）左右
准备质粒混合液体，总质量约8ug,三个质粒的摩尔数比约为1:1:1,总体积50ul,不足的用水补齐（见附件）
准备ssDNA, 6*25=55*3, PCR仪中94°10min,放冰上备用
30°预热液体YPDA培养基
2ml tube收集菌体 3000r/min离心，灭菌水洗两次
900ul水重悬菌体，加100ul 1M LiAc, 颠倒混匀，30°温浴5min，12000r/min 5s,收集菌体，弃除干净上清
用50ul的质粒混合液轻轻重悬菌体，加入36ul 1M LiAc 和25ul 变性处理后冰上保存的ssDNA,轻轻混匀后加入240ul 50%PEG6000，适当vortex混匀
42°水浴热击45min，30°培养箱预热SD平板
12000r/min  2min, 尽量弃除干净上清，加1ml YPDA(30°预热)/2ml tube, 手摇混匀
30°，200r/min 复苏1-2h
5000r/min 离心4min, 尽量弃除干净上清，加100ul灭菌水，重悬，吹吸混匀
涂板，30°培养3-4d，观察，照相
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2楼2013-05-03 16:35:07
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咭呀嘎

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhlsmile: 金币+1, 鼓励鼓励 2013-05-04 16:24:42
zhlsmile(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:25:03
我有做过双质粒共转酵母的实验，用的也是LiAc和PEG的方法，最后是用两种抗性筛选的。但是涂板之后，板上基本不长。猜想是因为共转效率比较低，而且是两种抗性筛选。所以我在涂板的同时还会同时取转化后的菌液进行摇菌，在含有两种抗生素的液体培养基培养后，再平板划线就可以得到单菌落，最后进行鉴定。希望能帮到你。
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3楼2013-05-03 19:10:06
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zhlsmile

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 咭呀嘎 at 2013-05-03 19:10:06
我有做过双质粒共转酵母的实验，用的也是LiAc和PEG的方法，最后是用两种抗性筛选的。但是涂板之后，板上基本不长。猜想是因为共转效率比较低，而且是两种抗性筛选。所以我在涂板的同时还会同时取转化后的菌液进行摇 ...

用液体摇 再涂板的话 长出来的单克隆有很大可能出自于同一个细胞 如果想选几个单克隆验证的话 很可能选到同一个 对吧？
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4楼2013-05-04 16:27:24
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咭呀嘎

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhlsmile at 2013-05-04 16:27:24
用液体摇 再涂板的话 长出来的单克隆有很大可能出自于同一个细胞 如果想选几个单克隆验证的话 很可能选到同一个 对吧？...

是有这种可能，看你的目的是什么吧。
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5楼2013-05-06 14:55:11
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飞扬~~~

新虫 (小有名气)
做三个质粒共转化，结果都不长，但对照的空白质粒都长 了好多，这是怎么回事？
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6楼2014-04-04 11:01:05
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c_jade

新虫 (初入文坛)
你的质粒单转可以吗？表达的蛋白是否有毒性。有做阳性对照吗？
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7楼2014-04-04 15:20:04
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