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永远不知道至尊木虫 (著名写手)
金花家族创始人
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[求助]
关于重组蛋白的一些问题
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1.最近在做转化和诱导，现在有一个问题，当目的基因连接到载体上面之后，诱导表达的蛋白质中除了含有目的基因表达的蛋白，是否还有载体表达的蛋白？ 2.如果有的话，那载体表达的蛋白是否和目的基因表达的蛋白连在一起还是分别表达，也就是说表达成两个蛋白？ 3.这个因该如何检测，是否要做一个质谱检测？如果要的话，请高手解释一下质谱的方法。 谢谢各位 |
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hy1050439829
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【答案】应助回帖
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永远不知道: 金币+20, ★★★很有帮助, 要是再详细点就好了 2013-04-27 15:49:36
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1. 理论上说，诱导的是表达载体上的特定启动子。一般的表达载体在多克隆位点上游是启动子，后面一般有终止子，所以终止子后面的序列不会受到诱导启动子的影响。当然，即使没有强启动子的作用，载体仍然可能表达一下蛋白，比方说抗性基因。所以，严格的说，做诱导最好能用空载体作为对照。 2. 不可能是连在一起的吧。你克隆基因是包括起始密码子和终止密码子的。即使没有终止子，也不可能是一个蛋白。融合蛋白需要把前面基因的终止密码子去掉。 3. 一般是先做诱导，跑SDS-PAGE. 如果能在目标蛋白分子量附近有明显诱导的蛋白，就可以初步确定。一般表达载体可能带有affinity tag，可以用tag的抗体做western。或者你有目标蛋白的特异性抗体，也可以检测。当然，打质谱也是可以鉴定的。如果你能纯化到蛋白，可以先做纯化，然后跑胶，挖带，trypsin消化成肽段。如果你有质谱，可以自己打质谱，否则可以送公司做。 |
4楼2013-04-27 14:33:16
永远不知道
至尊木虫 (著名写手)
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这是我瞎填着玩的 5楼2013-04-27 15:43:42
30