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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 芽孢杆菌敲除问题
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zd0017

铁虫 (小有名气)

[求助] 芽孢杆菌敲除问题

本人想做萎缩芽孢杆菌的基因筛选，想用新霉素做抗性筛选，现在手里有一个带有新霉素基因的质粒，但是不知道如何把该基因扩下来，是要扩多长可以做抗性筛选，要把启动子也扩出来吗？诚心求助大牛指教！！！！
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1楼 2013-04-22 16:43:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wuguang2013

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-05-15 13:46:51
做基因敲除的方法很多，最常见的就是转座子敲除，但是我最近在做双交换敲除法，用到两个文献，一个是关于自杀性质粒，一个是双交换敲除原理的，你可以试着看看。希望对你有帮助！
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乐天派广！牙齿天天晒太阳！！！
2楼2013-04-22 20:49:37
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by zd0017 at 2013-04-23 15:43:59
弱弱的问下楼上所说的Bt是那种菌，那如果做突变用到抗性筛选的话，如何获得抗性基因呢...

抗性基因的启动子一般是抗生素诱导的，一般都会表达的，基本不用担心不会表达。
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8楼2013-04-24 12:03:35
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清水一杯

新虫 (初入文坛)
★ ★
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫应助！ 2013-05-15 13:47:16
还得确定一下该新霉素基因是原本是用于原核生物还是真核生物的。二者的密码子并不一样。
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9楼2013-04-25 17:28:38
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
zhangxingc: 金币+3, 鼓励热心回帖应助 2013-04-28 10:11:29
引用回帖:
10楼: Originally posted by zd0017 at 2013-04-25 19:09:42
这个新霉素基因是从真核表达载体上扩下来的，难道不能用？？？有点不明白的是为什么载体上把这个抗性基因写成kanR/neoR是什么意思？难道是这两个抗性基因是序列相同吗？？...

一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因，该酶可是这两种抗生素磷酸化，从而干扰它们向细胞内主动转移以达到抗卡那霉素和新霉素的作用。
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11楼2013-04-27 19:57:39
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuguang2013 at 2013-04-22 20:49:37
做基因敲除的方法很多，最常见的就是转座子敲除，但是我最近在做双交换敲除法，用到两个文献，一个是关于自杀性质粒，一个是双交换敲除原理的，你可以试着看看。希望对你有帮助！

谢谢你啊，能否把这两篇文献发给我一下！！
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3楼2013-04-23 10:48:27
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你知道质粒的序列吗？如果知道就方便了，要把新霉素基因自身的所有序列都扩出来，包括上游的启动子序列（尽量往前都扩点）和后下游的终止序列（尽量往后多扩点）。我就是采用这样的策略从pET-28a中扩的卡纳抗性基因的，希望对你有用。
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4楼2013-04-23 11:33:15
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dmzha at 2013-04-23 11:33:15
你知道质粒的序列吗？如果知道就方便了，要把新霉素基因自身的所有序列都扩出来，包括上游的启动子序列（尽量往前都扩点）和后下游的终止序列（尽量往后多扩点）。我就是采用这样的策略从pET-28a中扩的卡纳抗性基因 ...

嗯，知道质粒序列的，就是不确定是否要扩启动子序列什么的，了解啦，谢谢
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5楼2013-04-23 13:49:53
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zhenfanren

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxingc: 金币+2, 鼓励新虫发帖应助，欢迎常到微生物版 2013-04-28 10:11:04
基因不能随便扩，就算扩了启动子，也未必可以在Bt里表达，这个基因最好是Bt里的，或是已经在BT里成功表达过了。
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6楼2013-04-23 14:55:36
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhenfanren at 2013-04-23 14:55:36
基因不能随便扩，就算扩了启动子，也未必可以在Bt里表达，这个基因最好是Bt里的，或是已经在BT里成功表达过了。

弱弱的问下楼上所说的Bt是那种菌，那如果做突变用到抗性筛选的话，如何获得抗性基因呢
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7楼2013-04-23 15:43:59
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 清水一杯 at 2013-04-25 17:28:38
还得确定一下该新霉素基因是原本是用于原核生物还是真核生物的。二者的密码子并不一样。

这个新霉素基因是从真核表达载体上扩下来的，难道不能用？？？有点不明白的是为什么载体上把这个抗性基因写成kanR/neoR是什么意思？难道是这两个抗性基因是序列相同吗？？
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10楼2013-04-25 19:09:42
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