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DEAE-纤维素的洗脱及再生
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| 最近使用纤维素52出现了问题 就是上柱之后洗脱的时候波峰变化不大 颜色分布不均匀 感觉洗脱不下来 打算重新上柱 可是柱子的再生处理不知道如何进行 能不能帮忙解答一下 谢谢啦 |
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user59888
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【答案】应助回帖
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我有以下建议: 建议一：柱子的规格。如果想大量的制备，当然是选择稍稍大的柱子。直径在2.0cm以上。 建议二：你上样量。可以稍稍加大点多糖的上样量。 建议三：多糖的浓度。你上样上了10ml。尽量减小上样体积，提高多糖浓度。 建议四：梯度洗脱的浓度选择。0.05-0.5这个浓度，你是随便选择的。什么浓度是最适合的，是需要实验依据的。你有两种方案选择：1、阶段性梯度洗脱：洗脱液的浓度从0、到2mol/L，选择适当的不同浓度，有低到高依次洗脱并分别收集。2、线性连续性梯度洗脱：洗脱浓度是从0-2mol/L，成线性、连续性洗脱，这种线性浓度你可以在去离子水中一边接入柱子，一边同时匀速加入高浓度的洗脱液2mol/L，同时不断搅拌（磁力搅拌器），使溶液浓度从0慢慢逐步提高。 建议四：你要对以上收集的收集液，逐管或者隔管检测多糖含量，从而来确定主峰的位置。以便选择适当的洗脱浓度，从而优化实验参数。 0.1％叠氮钠缓冲液的叠氮钠缓冲液，中的缓冲液一般缓冲液均可，一般用层析时的初始缓冲液，我们用的是0.0M 的Tris-HCl从未出现过问题。已用此方法保存了柱子一年，其间一直在使用。 柱子再生的方法有两类，1.是将整个柱子洗下来，然后再表面活性剂，NaCl，酸碱处理，这种处理方法比较费时，当然也比较彻底，现在这种方法用的比较少，除非柱子污染比较严重；现在通常的方法是2.在柱子用后直接处理，常用的洗涤液中可含有：NaCl、6M或8M 脲、有机溶剂（如醇类等）、表面活性剂等。 我给你的第二种方法应该是一种比较强的再生洗涤液，这个方法也是我最近查文献查的，因为我近来的这个实验中发现高盐洗涤不彻底，所以查到了这个方法，洗涤后要用大量的水将其中的表面活性剂去除，然后再用上柱起始缓冲液平衡。 |
2楼2013-04-19 17:55:31
3楼2013-04-20 08:41:18
4楼2013-04-20 23:21:06
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
lanlanbetty: 金币+4, ★有帮助 2013-04-21 20:31:24
lanlanbetty: 金币+4, ★有帮助 2013-04-21 20:31:24
| 对了还有填料的再生问题，你按照填料的说明书的要求，一般流程是这样的：柱平衡，进样，洗脱，每次洗脱结束的时候你要用你的洗脱液的高盐溶液冲洗3~4个柱体积，然后再用纯水冲洗以代替柱子里面存在的高盐，然后再做层析钱再一次地柱平衡，如此循环~~~当你发现做了好几次后测得的峰分离的不明显，你是否考虑一下你的填料是否有问题，因为填料保存不当的话会被微生物污染的，你问一下填料的气味正常不正常~~~我当时做的时候那个填料是臭的 我师兄没说，害的我白做了大半个月的时间 ~~ |
5楼2013-04-20 23:24:42
6楼2013-04-21 20:29:02
7楼2018-10-09 09:39:36
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本帖内容被屏蔽 |
8楼2022-06-30 15:06:36