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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白过纤维素柱的过程
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暖木warm

金虫 (正式写手)

[交流] 蛋白过纤维素柱的过程

请问，蛋白过纤维素柱怎么确定纤维素的用量？怎么做小试来确定梯度？玻璃柱过柱子之前怎么洗？越详细越好，新手不懂，感谢各位
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1楼2011-07-07 20:16:23
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★
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暖木warm(金币+1): 恩，是的。求解答，谢谢 2011-07-08 08:47:57
DEAE纤维素阴离子柱？

自装的？
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2楼2011-07-08 02:07:09
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yang0071

木虫 (职业作家)
★
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暖木warm(金币+4): 谢谢，因为是新手，不知道小试怎么做，能说一下具体步骤吗？越详细越好 2011-07-08 15:12:20
柱容量一般说明书上有，你自己算一下，开始先试3倍量。
小试用ep管作可以了，跟免疫沉淀类似；
洗柱，全新的玻璃柱，0.5% naoh 泡30min，水洗3遍，0.5% hcl 泡30min，水洗3遍。水只的是自来水，蒸馏水，去离子水。旧的话，可泡可不泡。
注意安全，虽然是弱酸弱碱，溅到也很难受的
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3楼2011-07-08 11:33:48
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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amisking(金币+6, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-08 20:07:43
暖木warm(金币+3): 非常感谢 2011-07-08 21:57:34
如果是填料，说明书可能是没有了。我这里有DEAE的说明书，我也用过这个层析柱。

空柱是要洗干净才行的，至于装柱，最好还是有连接器，不然装不实，如果有空隙效果就会差一点了。你说的玻璃柱也不一定要玻璃柱，你用其它材质的也行，如果是玻璃，用氢氧化钠洗的时候会有轻微的反应生成硅酸钠，所以材质最好选择能耐受高pH值的。

DEAE短时间内能耐受pH1-14，但要注意是短时间，最多冲洗2个柱床体积就要改变回去，最好是中性的。工作时候pH2-9，但考虑到蛋白质过酸过碱会变性，所以最好是5-8，具体是多少还要看你的蛋白质而定，最好是看看各个pH值下你的蛋白质的半寿期。

填料的用量我觉得还是首先要看看你有多少填料，填料足够了，你装多大都行。至于摸索条件之类的，你就装小的，5毫升就行，甚至1毫升也可以，这样就能很快冲洗完一个柱床体积了。因为一倍柱床体积是不足以冲洗完全的，所以每做一个浓度都应该冲洗多于一倍，我用5倍，柱床体积越小就越节省时间。

至于摸索完洗脱条件之后，就要用来分离制备样品，这时候用柱床体积大的，有利于结合较多的蛋白质，一次制备较多的蛋白质。你可以装个20毫升的，随你了。

自己装的层析柱如果接头合适，那也能用蛋白质纯化仪的，那就不用装小柱，直接装大柱了，洗脱条件也不用摸索了，直接走0-100%氯化钠连续线性梯度。
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4楼2011-07-08 19:06:41
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