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暖木warm

金虫 (正式写手)


[交流] 蛋白过纤维素柱的过程

请问,蛋白过纤维素柱怎么确定纤维素的用量?怎么做小试来确定梯度?玻璃柱过柱子之前怎么洗?越详细越好,新手不懂,感谢各位
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yang0071

木虫 (职业作家)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
暖木warm(金币+4): 谢谢,因为是新手,不知道小试怎么做,能说一下具体步骤吗?越详细越好 2011-07-08 15:12:20
柱容量一般说明书上有,你自己算一下,开始先试3倍量。
小试用ep管作可以了,跟免疫沉淀类似;
洗柱,全新的玻璃柱,0.5% naoh 泡30min,水洗3遍,0.5% hcl 泡30min,水洗3遍。水只的是自来水,蒸馏水,去离子水。旧的话,可泡可不泡。
注意安全,虽然是弱酸弱碱,溅到也很难受的
3楼2011-07-08 11:33:48
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
暖木warm(金币+1): 恩,是的。求解答,谢谢 2011-07-08 08:47:57
DEAE纤维素阴离子柱?

自装的?
2楼2011-07-08 02:07:09
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★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
amisking(金币+6, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-08 20:07:43
暖木warm(金币+3): 非常感谢 2011-07-08 21:57:34
如果是填料,说明书可能是没有了。我这里有DEAE的说明书,我也用过这个层析柱。

空柱是要洗干净才行的,至于装柱,最好还是有连接器,不然装不实,如果有空隙效果就会差一点了。你说的玻璃柱也不一定要玻璃柱,你用其它材质的也行,如果是玻璃,用氢氧化钠洗的时候会有轻微的反应生成硅酸钠,所以材质最好选择能耐受高pH值的。

DEAE短时间内能耐受pH1-14,但要注意是短时间,最多冲洗2个柱床体积就要改变回去,最好是中性的。工作时候pH2-9,但考虑到蛋白质过酸过碱会变性,所以最好是5-8,具体是多少还要看你的蛋白质而定,最好是看看各个pH值下你的蛋白质的半寿期。

填料的用量我觉得还是首先要看看你有多少填料,填料足够了,你装多大都行。至于摸索条件之类的,你就装小的,5毫升就行,甚至1毫升也可以,这样就能很快冲洗完一个柱床体积了。因为一倍柱床体积是不足以冲洗完全的,所以每做一个浓度都应该冲洗多于一倍,我用5倍,柱床体积越小就越节省时间。

至于摸索完洗脱条件之后,就要用来分离制备样品,这时候用柱床体积大的,有利于结合较多的蛋白质,一次制备较多的蛋白质。你可以装个20毫升的,随你了。

自己装的层析柱如果接头合适,那也能用蛋白质纯化仪的,那就不用装小柱,直接装大柱了,洗脱条件也不用摸索了,直接走0-100%氯化钠连续线性梯度。
4楼2011-07-08 19:06:41
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