应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于cDNA的疑惑
111/2返回列表12下一页
查看: 1690  |  回复: 24
查看全部回帖@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)

[求助] 关于cDNA的疑惑

菜鸟一枚，请教一下高手们：
1、RT-PCR 常用模板有细胞总RNA或从总RNA分离纯化的mRNA ，请问什么时候用总RNA什么时候合适用mRNA ，两种模板各有什么优势和缺点，各针对什么目的？
2、我在看文献时，有的是直接从从cDNA 序列中找到基因再克隆表达，有的构建了cDNA 文库，请问二者的区别，什么情况下需要构建cDNA 文库呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2013-04-18 15:55:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by panyuzhu at 2013-04-18 20:26:03
1. 以mRNA来源的是cDNA文库。
2. 以总RNA来源的是基因组DNA文库。


库 库  专业点好不好，你以为是优衣裤啊!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!这种答案都被采纳。小木虫让人捉急啊

基因组DNA文库是直接从提取DNA来的吧，为啥还绕弯从总RNA出发？
赞一下 回复此楼
4楼2013-04-18 21:02:08
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sl35537417 at 2013-04-18 19:17:27
一般来说都是提取总RNA 然后反转cDNA 在进行克隆；除非特殊要求的实验才用纯mRNA。
其实上无论是总RNA 反转得到的cDNA  还是纯mRNA反转得到的cDNA  都应该是文库，因为理论上里面都包括了所有基因的cDNA    个人觉 ...

那什么样要求的实验才要用纯mRNA ?
赞一下 回复此楼
5楼2013-04-18 21:02:45
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-04-19 00:12:24
就我所知，一般提取纯的mRNA是用来建转录RNA库的，一般用于测序。因为我们所提取的RNA中90%-98%都是rRNA，这样在测序时扑获到都是rRNA，而mRNA很难得到，就需要将mRNA提取出来。
而一般进行基因克隆的时候，所翻转 ...

谢谢！从我的目的来看，我是要得到某种微生物里面的酶，而这个微生物的基因序列未知。我从提取mRNA、建cDNA 文库出发，比从提取DNA出发构建基因组文库，要更合适些，不知道是不是可以这样理解？
赞一下 回复此楼
8楼2013-04-19 08:39:28
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-04-19 14:56:55
得到酶？你是指克隆这个酶的基因么？如果这样的话，就用RNA来做就行。至于要不要搞到建库这么复杂呢，你再考虑一下。如果是一种酶就没必要建库了吧。
如果仅仅是得到酶的话，从蛋白的水平入手就行啦。那岂不是更快...

但是这个微生物以及这个酶的基因序列都未知呢？我的目的是要找到这段酶的基因，并且实现克隆表达。
赞一下 回复此楼
12楼2013-04-19 15:01:20
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-04-19 14:56:55
得到酶？你是指克隆这个酶的基因么？如果这样的话，就用RNA来做就行。至于要不要搞到建库这么复杂呢，你再考虑一下。如果是一种酶就没必要建库了吧。
如果仅仅是得到酶的话，从蛋白的水平入手就行啦。那岂不是更快...

要表达出这个酶的蛋白质，在无细胞的情况下完成其催化功能。
赞一下 回复此楼
13楼2013-04-19 15:03:07
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-04-19 15:05:53
那你知道这个酶是什么酶吗？...

这个知道。但是这个酶在不同的物种里面同源性并不高。
赞一下 回复此楼
18楼2013-04-21 17:31:38
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
20楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-04-22 10:55:28
第一：RT-PCR的模板不是RNA或mRNA,RT是反转录的意思，所以模板是cDNA。第二如果知道基因的cDNA序列，做RT-PCR是直接提取总RNA，然后反转成cDNA做模板，利用特异性引物，进行PCR就行。mRNA一般是为了建某一特殊时期的 ...

谢谢你回答得这么详细清晰！我的目的是从一个基因序列未知的微生物里找到其糖基转移酶的基因，再克隆表达出这种酶，然而这个微生物里面该酶的基因序列也未有报道。
赞一下 回复此楼
21楼2013-04-22 11:13:24
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-04-22 03:28:38
那你是怎么想的呢？要建什么样的库，建库之后怎么测呢？
如果知道该酶，还是同源克隆比较靠谱吧，建库过程复杂，而且你只要一种酶，建库之后有那么多的候选基因，你又如何选择呢？
若是能将这酶提出来，直接打质 ...

我的目的是从这个基因序列未知的微生物里面找到糖基转移酶的基因，再克隆表达出酶，而该微生物的糖基转移酶基因序列也是未知的。
赞一下 回复此楼
22楼2013-04-22 11:20:29
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-04-22 11:44:04
那就使用其他物种里的同类基因序列，设计引物，同源克隆这个基因，然后连载体，表达蛋白，分离纯化酶！！!

我现在的想法是提RNA，逆转录成cDNA，接下来就是你说的这样了。我还有个疑问，假如直接提取DNA来做，跟提RNA逆转录成cDNA来做有什么区别？这两种策略各在什么情况下选择，对结果又有何影响。
赞一下 回复此楼
24楼2013-04-22 18:06:26
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 飘雪3889 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭