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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于cDNA的疑惑
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飘雪3889

木虫 (小有名气)
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20楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-04-22 10:55:28
第一：RT-PCR的模板不是RNA或mRNA,RT是反转录的意思，所以模板是cDNA。第二如果知道基因的cDNA序列，做RT-PCR是直接提取总RNA，然后反转成cDNA做模板，利用特异性引物，进行PCR就行。mRNA一般是为了建某一特殊时期的 ...

谢谢你回答得这么详细清晰！我的目的是从一个基因序列未知的微生物里找到其糖基转移酶的基因，再克隆表达出这种酶，然而这个微生物里面该酶的基因序列也未有报道。
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21楼2013-04-22 11:13:24
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飘雪3889

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-04-22 03:28:38
那你是怎么想的呢？要建什么样的库，建库之后怎么测呢？
如果知道该酶，还是同源克隆比较靠谱吧，建库过程复杂，而且你只要一种酶，建库之后有那么多的候选基因，你又如何选择呢？
若是能将这酶提出来，直接打质 ...

我的目的是从这个基因序列未知的微生物里面找到糖基转移酶的基因，再克隆表达出酶，而该微生物的糖基转移酶基因序列也是未知的。
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22楼2013-04-22 11:20:29
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

那就使用其他物种里的同类基因序列，设计引物，同源克隆这个基因，然后连载体，表达蛋白，分离纯化酶！！!
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23楼2013-04-22 11:44:04
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飘雪3889

木虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-04-22 11:44:04
那就使用其他物种里的同类基因序列，设计引物，同源克隆这个基因，然后连载体，表达蛋白，分离纯化酶！！!

我现在的想法是提RNA，逆转录成cDNA，接下来就是你说的这样了。我还有个疑问，假如直接提取DNA来做，跟提RNA逆转录成cDNA来做有什么区别？这两种策略各在什么情况下选择，对结果又有何影响。
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24楼2013-04-22 18:06:26
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果是以DNA序列设计的引物就提DNA，如果是以mRNA或者cDNA序列设计的引物就提RNA。以DNA设计的引物，提RNA可能引物根本不能用，因为DNA上有内含子，如果正好在内含子区域设计引物，那就不能提RNA做。如果以cDNA活mRNA设计引物，基因内部内含子比较大的话，你提DNA还是不能做出来。太长的片段不好扩增。
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25楼2013-04-24 10:02:44
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