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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于免疫组化SABC法的一些疑惑？
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lipei98989

新虫 (小有名气)

[交流] 关于免疫组化SABC法的一些疑惑？已有1人参与

我的本科毕业论文，实验技术是免疫组化SABC法，最近一直在试图彻底弄懂这套技术的整个原理，仍有几点疑惑，望大家能为我指点迷津：
比方说我要做的是对动物A生长抑制素的定位及定量，那么我的简单理解是：用动物A中的生长抑制素（纯抗原）去接种动物B，使其产生单克隆性的一抗（1种效应B淋巴细胞产生的），再用此单克隆性一抗接种动物C,使其产生相应的多克隆性抗体(此抗体是多种效应B淋巴细胞产生的)(另外就是未用一抗接种动物C时，动物C的血清液可作为封闭液)，把二抗和生物素结合上，与二抗结合的生物素再和霉链亲和素结合（霉链亲和素能与4个生物素结合），霉链亲和素再结合另外三个生物素，另外的三个生物素外连接的是辣根过氧化物酶，最后又辣根过氧化物酶催化二氨基联苯胺（DAB）得棕色沉淀物而显色。
有几点疑惑：
1.这套技术最根本的起点是抗原，那这个抗原一般是在动物组织中哪？比如我认为：生长抑制素可在分泌该物质的细胞的细胞基质中（核膜、细胞膜上不知会不会附着），组织液中，前者的话，我觉得，这样定位、定量才有意义，就是把原细胞定出来了，若是后者的话有何意义？？其它像什么5-HT,NPY等呢？
2.关于未经一抗免疫处理的封闭液血清（和二抗是相同动物的来源）怎么就能封闭掉原抗原动物体内对一抗的非特异性吸附呢？封闭液血清的封闭原理？？
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1楼2012-03-04 14:12:35
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liujiali006

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1、用IHC方法检测生长抑素，阳性信号应该在细胞质中，5-HT和NPY也如此。即便是IHC检测存在于胞膜上的某些抗原如激素的膜受体，从切片的最终结果（DAB）上看，也象是胞质显色（免疫荧光的方法可能好些）。不同的抗原存在于细胞中的位置不同，如核受体及转录因子一般存在于胞核中，激素及递质类物质存在于胞质中，负责胞膜转运的载体和胞膜受体存在于胞膜上，这些可从文献中得到基本信息。
2、封闭的问题：理论上，组织上的游离醛基会与蛋白发生非特异结合，而我们用的二抗即IgG是蛋白质，当我们用与二抗相同来源的未免疫血清（含大量IgG）作了封闭后，标记二抗就只能和已与组织内抗原发生特异结合的一抗发生反应，从而防止非特异反应的发生。
不知道说清楚没有。
祝 顺利！
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lipei98989
2楼2012-03-06 11:19:54
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lipei98989

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by liujiali006 at 2012-03-06 11:19:54:
1、用IHC方法检测生长抑素，阳性信号应该在细胞质中，5-HT和NPY也如此。即便是IHC检测存在于胞膜上的某些抗原如激素的膜受体，从切片的最终结果（DAB）上看，也象是胞质显色（免疫荧光的方法可能好些）。不同的抗 ...

哦！我大致明白了，非常、非常的感谢！！
言下之意是否为：用未免疫血清封闭（步骤一般都是在滴加一抗之前）主要就是为了封闭掉组织中游离的醛基（这个醛基可能组织中本身就是，可能大部分还是由于组织用多聚甲醛固定是残留的），这样就为一抗结合抗原扫清障碍，自然而然的二抗就可以特意结合上去，防止假阳性。
一言而概之;就是防止游离醛基结合一、二抗。
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3楼2012-03-06 12:56:54
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liujiali006

铁杆木虫 (正式写手)
对滴！！
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4楼2012-03-06 14:07:56
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