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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真核转染表达，求助
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1338070201

新虫 (初入文坛)

[求助] 真核转染表达，求助

各位大神，我将我的蛋白克隆到一个带有puro抗性的真核质粒上，想筛选稳转。但是可能是我蛋白带有核酸内切酶活性的缘故，瞬时转染在293T细胞中都不表达。我想问问有什么解决方法，换质粒行吗？有哪些质粒可供选择？
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一切成功来源于脚踏实地
1楼 2013-04-01 11:18:20
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nlbtr

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1338070201: 金币+5, ★有帮助 2013-04-02 15:37:44
即便有核酸内切酶活性，瞬时表达后，也应该能拿到目的蛋白啊。
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2楼2013-04-01 12:02:20
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1338070201

新虫 (初入文坛)
应该就是不表达啊，western和免疫荧光检测不到，puro筛选稳转全部死光，真的让我很死机啊
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一切成功来源于脚踏实地
3楼2013-04-01 15:21:33
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here0009

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1338070201: 金币+25, ★★★很有帮助 2013-04-02 15:37:26
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 18:08:49
你把内切酶活性的关键位点突变掉看下是否可以表达，如果可以，则说明是内切酶活性而非载体的原因。可能再换载体也没什么用了。不过你最好还是一些参考内切酶表达的文献看看吧，
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Forthemoon
4楼2013-04-02 15:28:00
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nlbtr

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1338070201 at 2013-04-01 15:21:33
应该就是不表达啊，western和免疫荧光检测不到，puro筛选稳转全部死光，真的让我很死机啊

要确定您的质粒是否已经转进去，转染条件之前摸索好了吗？
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5楼2013-04-02 16:42:31
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
想要构建稳定细胞系，这种情况的话，应该确定质粒有没有转进去，楼上说的对的，其次在考虑转染效率
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
6楼2015-11-09 17:08:10
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
不同的转染方法，可以参考 细胞转染方法比较，如果转进去了，在从转染方法上考虑，包括用的转染试剂，细胞的状态很多问题都要考虑啊
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-11-09 17:10:00
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