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thinkdoll

金虫 (小有名气)

[交流] 神奇现象！ cDNA做3‘-RACE的结果，求解释！

小虫第一次尝试着做RACE, 见解浅薄，请各位大侠多指教！
现象时这样的：
反转录后cDNA做3‘-RACE得到的测序结果中间存在许多终止子。
如果按第一个终止子算的话，显然基因没那么短。
并且无论拿整个蛋白序列或是终止子前的序列blast都不和我预计的蛋白同源。（每个race的结果都取了4~5个克隆测序，结果都不太相同，而且中间都存在若干终止子）

请问大家做RRACE的时候有这种状况么？
还有一般需要筛选多少个克隆才能得到目的片段呢？
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1楼 2013-03-27 14:03:56
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
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thinkdoll: 金币+2 2013-03-28 22:06:21
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-29 16:04:49
终止子不是大问题，一方面不一定是按照这个ORF来到，另一方面某些情况下终止子只是部分终止，并非100%地终止（细胞生物学上讲过）
你这个序列blast的结果是什么呢？同源序列是你的物种里面的么？
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2楼2013-03-27 15:53:25
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thinkdoll

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-03-27 15:53:25
终止子不是大问题，一方面不一定是按照这个ORF来到，另一方面某些情况下终止子只是部分终止，并非100%地终止（细胞生物学上讲过）
你这个序列blast的结果是什么呢？同源序列是你的物种里面的么？

谢谢你的回复！
orf就是这个没错的。我想作为不完全终止这种情况未免也太特殊了。
我做的物种很小众，基因库里没啥序列。blast得到的同源序列分值也都不高，score30~40%，identity 20~30.感觉也看不出是啥来。
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3楼2013-03-28 22:04:40
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robustli

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
think about your polymerase, if it is Taq ploymerase, the stop codon might be  created by the Taq ploymerase
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4楼2013-03-28 23:47:37
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
thinkdoll(gyesang代发): 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-27 21:06:43
你直接将PCR产物送测序的么？还是连接了载体，转化了感受态？
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5楼2013-03-29 08:33:00
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platanus

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议用高保真的酶扩增，我估计是你的PCR过程中错配率太高了的原因，没有测到真正的序列！
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6楼2013-03-29 09:10:13
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thinkdoll

金虫 (小有名气)
我也曾担心过错配或移码突变的问题。按此思路分析序列也没有好的结果。
我所用的是高保真的taq，并且其中分别的两次race后，连入载体测序结果各有一个克隆序列及终止子的位置是一致的。
所以，可能不是上面各位同学分析的原因。
大家还有没有别的思路啊？ 难道果然只有我遇到么？

ps：3‘-utr 能有200~1000bp那么长么？
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7楼2013-03-29 11:33:28
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xhlxhl

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
thinkdoll: 金币+4 2013-03-29 12:31:20
能和你的目的基因部分重合么，能确定扩增的是目的基因么？首先要确定这个问题
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8楼2013-03-29 12:18:44
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thinkdoll

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xhlxhl at 2013-03-29 12:18:44
能和你的目的基因部分重合么，能确定扩增的是目的基因么？首先要确定这个问题

谢谢你的回帖
扩增的不是我要的基因。
不过我好奇的是cDNA上为什么会有这么多终止子。
可能是我先入为主的想法吧，觉得基因不止这么短。既然不是我要的基因，现在越来越觉得可能是3’-utr的原因了。
感谢你的提醒！

大家还有什么好的思路呢？
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9楼2013-03-29 12:30:59
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shangrila911

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
thinkdoll: 金币+1, thank you! 最后一个金币了。请笑纳 2013-05-07 19:13:46
如果你分析了之后不是错配或移码突变原因   那就只能从最开始分析了  很可能是你的引物有问题
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10楼2013-04-07 13:47:56
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