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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 5'race 没有结果，求高人指点
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数峰青1989

铁虫 (小有名气)

[求助] 5'race 没有结果，求高人指点

近一段时间在用takara的试剂盒做5'race，但是第二次PCR之后怎么也得不到一个清晰的条带。。。实验结果如所附图，请高人指点一二

RNA分离结果（该结果说明rna提取很成功，可以做下一步实验）.jpg



2次PCR之后产物电泳结果（没有条带，原因是什么，请高人指点）.jpg
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1楼 2013-03-22 16:40:30
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数峰青1989

铁虫 (小有名气)
难道没人知道是什么情况么
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2楼2013-03-26 21:35:02
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-29 16:03:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-31 16:15:43
there are so many reasons such as the quality of the cDNA library, annealing temperature, primer specificity,elongation time. I guess you may need check them one by one. I usually use primer 5 to design my primer, there are other primers design software you can choose. after this try different annealing temperature, sometimes you can add DMSO if the template is GC-rich. At the same time, give it enough extention time. If your target gene is rare, you can also try the nested PCR.
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immunologyparasite
3楼2013-03-27 02:02:13
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数峰青1989

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by robustli at 2013-03-27 02:02:13
there are so many reasons such as the quality of the cDNA library, annealing temperature, primer specificity,elongation time. I guess you may need check them one by one. I usually use primer 5 to des ...

谢谢啦，最近的几周里，我做了梯度PCR和巢式PCR，不断的在优化PCR的条件，但是始终得不到结果。于是我就想可能是我自己提取mRNA的过程中出现了问题。我计划再重新提取一遍。不过我有点疑惑：我要提的那个基因的产物是次级代谢产物，我所用的材料是苔藓类植物，我是要选用很嫩的植株，还是选长的时间稍微长一点的植株啊
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4楼2013-03-29 15:28:52
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
数峰青1989(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 16:16:18
你提取的RNA质量很好，不知道你反转录之后有没有检测过反转录的质量，还有5‘RACE比较难做，跟引物、退火温度等等原因都有关系，多做一些尝试吧！
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5楼2013-03-29 17:32:11
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数峰青1989

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by platanus at 2013-03-29 17:32:11
你提取的RNA质量很好，不知道你反转录之后有没有检测过反转录的质量，还有5‘RACE比较难做，跟引物、退火温度等等原因都有关系，多做一些尝试吧！

谢谢啦。。。提取完RNA之后，我就照着takara试剂盒上的步骤一步一步的做，真不知道怎么回事。。。
反转录之后怎么检测反转录的质量啊。。。这个真没有做，也不知道
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6楼2013-03-29 21:06:12
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platanus

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 数峰青1989 at 2013-03-29 21:06:12
谢谢啦。。。提取完RNA之后，我就照着takara试剂盒上的步骤一步一步的做，真不知道怎么回事。。。
反转录之后怎么检测反转录的质量啊。。。这个真没有做，也不知道...

反转录之后要用看家基因检测一下反转录的质量的，因为也有可能问题出现在反转录过程的！
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7楼2013-03-29 22:13:07
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robustli

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 数峰青1989 at 2013-03-29 15:28:52
谢谢啦，最近的几周里，我做了梯度PCR和巢式PCR，不断的在优化PCR的条件，但是始终得不到结果。于是我就想可能是我自己提取mRNA的过程中出现了问题。我计划再重新提取一遍。不过我有点疑惑：我要提的那个基因的产物 ...

Can you do a qpcr to detect at which state your gene express higher?
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immunologyparasite
8楼2013-03-29 22:20:15
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数峰青1989

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by platanus at 2013-03-29 22:13:07
反转录之后要用看家基因检测一下反转录的质量的，因为也有可能问题出现在反转录过程的！...

我检测了一下反转录产物的质量，没有任何条带，只有在100bp至300bp左右有弥散的一块。。。这样说一定就是反转录出问题了。。。我再做一下试试
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9楼2013-04-01 10:38:05
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