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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 奇怪的连接反应
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cuicchao

金虫 (正式写手)

[交流] 奇怪的连接反应

大家好！近来在做目的基因和质粒的连接，在转化时出现了一个奇怪的现象，请教大家分析下。我回收的目的基因和载体都还是比较纯的（用的是OMEGA试剂盒提取的)。我用TAKARA的solution1，16摄氏度，45min连接，之后直接转化DH5阿尔法，我做了全菌的PCR，再提取质粒PCR结果都有正确的结果，但是我跑质粒和双酶切的核算电泳胶都没有条带。这是问什么呢？！！！
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1楼 2013-03-08 10:33:17
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
kx444555: 金币+2, 很详细 2013-03-10 10:30:50
全菌PCR有可能是连接转化过程中连接使用的片段有沾到菌体上造成污染

至于卤煮说提取质粒后PCR也有片段，这个看来可以排除上面的情况，但是会怀疑有可能是PCR使用的试剂有污染，建议卤煮设置负对照，譬如空载为模板的，以及不加入模板的，如果负对照有P出，则证明有污染。

卤煮所谓的跑质粒没有条带是什么意思？是没有大小正确的目的带还是神码都没有？
如果是没有目的带的话，也许是超螺旋结构导致重组子质粒和空载质粒跑胶距离差别不大，建议跑远一点，凝胶浓度也可以调整一下。

双酶切鉴定算是可下结论的鉴定，卤煮可以考虑排除酶失活，反应体系错误，质粒没有抽取好等情况
如果卤煮手抽质粒非试剂盒抽取，没有把离子浓度调整好，很有可能导致无法酶切，百分之七十的酒精多洗几次再酶切验证试试吧

希望有帮助到卤煮！
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15楼2013-03-09 12:26:59
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无为书生

铁虫 (小有名气)
★
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
全菌PCR和质粒PCR很可能是你的PCR体系污染了，建议做阴性对照，16度连45min是不是有点短，不要太相信连接酶的说明书了。
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2楼2013-03-08 10:48:15
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-08 10:48:15
全菌PCR和质粒PCR很可能是你的PCR体系污染了，建议做阴性对照，16度连45min是不是有点短，不要太相信连接酶的说明书了。

不加目的基因和质粒做个阴性对照吗？
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3楼2013-03-08 10:53:31
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无为书生

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cuicchao at 2013-03-08 10:53:31
不加目的基因和质粒做个阴性对照吗？...

不是，其实是每次做PCR时都应该做阴性对照的，就是PCR体系一样，但是模板用超纯水代替，PCR条件之类的也要完全一致。
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4楼2013-03-08 10:58:53
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-08 10:58:53
不是，其实是每次做PCR时都应该做阴性对照的，就是PCR体系一样，但是模板用超纯水代替，PCR条件之类的也要完全一致。...

哦，谢谢，下次再试试。我想啊是不是有我的目的基因片段转进去了。PCR太灵敏了，不可靠！
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5楼2013-03-08 11:08:44
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cuicchao

金虫 (正式写手)
谁有同样的现象分享一下经验吧，做这个转化好久了，苦逼啊！！！
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6楼2013-03-08 11:17:11
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
是不是已经污染过的哦~~~~~~~~~~~~~
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7楼2013-03-08 11:19:38
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无为书生

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cuicchao at 2013-03-08 11:08:44
哦，谢谢，下次再试试。我想啊是不是有我的目的基因片段转进去了。PCR太灵敏了，不可靠！...

你的目的片段很可能没有转进去，菌落PCR，跑质粒都没有双酶切和测序的结果准确，不要过分依赖前二者，只能作为初筛手段而已。
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9楼2013-03-08 11:23:03
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by userhung at 2013-03-08 11:19:38
是不是已经污染过的哦~~~~~~~~~~~~~

污染，这个因素就很多了吧！？
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10楼2013-03-08 15:01:22
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554526385

铜虫 (小有名气)
★
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
菌落PCR结果是不准确的，在你涂的平板上是有很多目的基因片段的，你挑菌之后PCR，即使是空载，也有未连接的目的基因片段做模版的。两个引物分别用载体上的和目的片段上的来做PCR，就会很准确。
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11楼2013-03-08 18:08:23
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 554526385 at 2013-03-08 18:08:23
菌落PCR结果是不准确的，在你涂的平板上是有很多目的基因片段的，你挑菌之后PCR，即使是空载，也有未连接的目的基因片段做模版的。两个引物分别用载体上的和目的片段上的来做PCR，就会很准确。

“两个引物分别用载体上的和目的片段上的来做PCR。”——你是说将来PCR的结果片段是包含载体一部分碱基，目的基因的一部分碱基。对吗？
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12楼2013-03-08 22:04:47
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554526385

铜虫 (小有名气)
是。这样子可以避免假阳性结果。
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13楼2013-03-08 23:12:46
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 逆天打酱油 at 2013-03-09 12:26:59
全菌PCR有可能是连接转化过程中连接使用的片段有沾到菌体上造成污染

至于卤煮说提取质粒后PCR也有片段，这个看来可以排除上面的情况，但是会怀疑有可能是PCR使用的试剂有污染，建议卤煮设置负对照，譬如空载为模 ...

恩，这样不错，我下次做的时候设几个对照，谢谢了！另外我说的没条带意思是什么也没有。
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16楼2013-03-09 20:22:57
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简单回复
champ8楼
2013-03-08 11:22   回复  
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
yingying158814楼
2013-03-09 09:53   回复  
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
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