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cuicchao

金虫 (正式写手)

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[交流] 奇怪的连接反应

大家好！近来在做目的基因和质粒的连接，在转化时出现了一个奇怪的现象，请教大家分析下。我回收的目的基因和载体都还是比较纯的（用的是OMEGA试剂盒提取的)。我用TAKARA的solution1，16摄氏度，45min连接，之后直接转化DH5阿尔法，我做了全菌的PCR，再提取质粒PCR结果都有正确的结果，但是我跑质粒和双酶切的核算电泳胶都没有条带。这是问什么呢？！！！

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1楼 2013-03-08 10:33:17

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逆天打酱油

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
kx444555: 金币+2, 很详细 2013-03-10 10:30:50

全菌PCR有可能是连接转化过程中连接使用的片段有沾到菌体上造成污染

至于卤煮说提取质粒后PCR也有片段，这个看来可以排除上面的情况，但是会怀疑有可能是PCR使用的试剂有污染，建议卤煮设置负对照，譬如空载为模板的，以及不加入模板的，如果负对照有P出，则证明有污染。

卤煮所谓的跑质粒没有条带是什么意思？是没有大小正确的目的带还是神码都没有？
如果是没有目的带的话，也许是超螺旋结构导致重组子质粒和空载质粒跑胶距离差别不大，建议跑远一点，凝胶浓度也可以调整一下。

双酶切鉴定算是可下结论的鉴定，卤煮可以考虑排除酶失活，反应体系错误，质粒没有抽取好等情况
如果卤煮手抽质粒非试剂盒抽取，没有把离子浓度调整好，很有可能导致无法酶切，百分之七十的酒精多洗几次再酶切验证试试吧

希望有帮助到卤煮！