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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 奇怪的连接反应
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cuicchao

金虫 (正式写手)

[交流] 奇怪的连接反应

大家好！近来在做目的基因和质粒的连接，在转化时出现了一个奇怪的现象，请教大家分析下。我回收的目的基因和载体都还是比较纯的（用的是OMEGA试剂盒提取的)。我用TAKARA的solution1，16摄氏度，45min连接，之后直接转化DH5阿尔法，我做了全菌的PCR，再提取质粒PCR结果都有正确的结果，但是我跑质粒和双酶切的核算电泳胶都没有条带。这是问什么呢？！！！
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1楼 2013-03-08 10:33:17
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无为书生

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cuicchao at 2013-03-08 11:08:44
哦，谢谢，下次再试试。我想啊是不是有我的目的基因片段转进去了。PCR太灵敏了，不可靠！...

你的目的片段很可能没有转进去，菌落PCR，跑质粒都没有双酶切和测序的结果准确，不要过分依赖前二者，只能作为初筛手段而已。
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9楼2013-03-08 11:23:03
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无为书生

铁虫 (小有名气)
★
cuicchao(金币+2): 谢谢参与
全菌PCR和质粒PCR很可能是你的PCR体系污染了，建议做阴性对照，16度连45min是不是有点短，不要太相信连接酶的说明书了。
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2楼2013-03-08 10:48:15
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cuicchao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-08 10:48:15
全菌PCR和质粒PCR很可能是你的PCR体系污染了，建议做阴性对照，16度连45min是不是有点短，不要太相信连接酶的说明书了。

不加目的基因和质粒做个阴性对照吗？
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3楼2013-03-08 10:53:31
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无为书生

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cuicchao at 2013-03-08 10:53:31
不加目的基因和质粒做个阴性对照吗？...

不是，其实是每次做PCR时都应该做阴性对照的，就是PCR体系一样，但是模板用超纯水代替，PCR条件之类的也要完全一致。
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4楼2013-03-08 10:58:53
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