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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

[求助] Native-PAGE

求助:
小弟最近在做Native-PAGE,12%的分离胶、6%的浓缩胶,Tris-甘氨酸电泳buffer,与SDS-PAGE的区别就是这三种都没有加SDS,其他成分一样。110V冰浴电泳,电流基本在10-20mA。电泳完成后切割部分条带进行考染。

出现问题是:我的蛋白都堆积在点样位置,并没有进行迁移。请高手解答,在线等,谢谢!
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-03-05 20:22:05
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-05 20:22:09
是你的蛋白的等电点的问题,我不记得是偏酸还是偏碱的话,就在上样孔那里下不去了。可以尝试:往loading buffer里面加一点SDS,使得SDS在样品中的终浓度为0.0003%,室温放置一会然后上样,这样可以避免电荷对电泳的影响,或者换个缓冲液系统,好像还有另一种缓冲液系统,具体不记得了
5楼2013-03-05 18:57:10
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普通回帖

Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流! 2013-03-05 20:21:59
你的是什么样品没给出来。看起来像是标准品?
如果是标准品的话,查查该蛋白等电点。
调整下溶液pH 试试?
2楼2013-03-05 15:54:00
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Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还有种可能,确保电极没接反么。。。?
3楼2013-03-05 15:54:54
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xingyel

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有可能时间太短,非变性跑的慢一些
4楼2013-03-05 17:21:13
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有个可能,在上样孔那里,有可能是你的蛋白是很大的聚体状态,我的就是这样的,在上样孔那里不下去。聚体太大了,七八百KDa。
6楼2013-03-05 18:58:38
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-05 18:58:38
还有个可能,在上样孔那里,有可能是你的蛋白是很大的聚体状态,我的就是这样的,在上样孔那里不下去。聚体太大了,七八百KDa。

但是我做的是个预实验,蛋白是已经纯化复性好的。。。
7楼2013-03-05 19:41:10
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-05 18:57:10
是你的蛋白的等电点的问题,我不记得是偏酸还是偏碱的话,就在上样孔那里下不去了。可以尝试:往loading buffer里面加一点SDS,使得SDS在样品中的终浓度为0.0003%,室温放置一会然后上样,这样可以避免电荷对电泳的 ...

恩,我也认为等电点对native-Page的影响比较大,但是我不知道这个蛋白的信息,没法确定他的等电点,难道还要先去测下等电点么。。。我一直按照酸性蛋白的操作电泳,明天尝试下碱性的。谢谢!
8楼2013-03-05 19:44:28
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Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 麦子绿豆 at 2013-03-05 19:44:28
恩,我也认为等电点对native-Page的影响比较大,但是我不知道这个蛋白的信息,没法确定他的等电点,难道还要先去测下等电点么。。。我一直按照酸性蛋白的操作电泳,明天尝试下碱性的。谢谢!...

如果你知道蛋白序列,即使是名称,也可以到数据库查啊
9楼2013-03-07 11:54:37
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Ocean_star

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该是你的蛋白的等电点与缓冲体系的问题,建议换个缓冲液,再是做Native-PAGE时,可以只用分离胶。
10楼2013-03-08 09:40:34
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