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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

[求助] Native-PAGE

求助：
小弟最近在做Native-PAGE，12%的分离胶、6%的浓缩胶，Tris-甘氨酸电泳buffer，与SDS-PAGE的区别就是这三种都没有加SDS，其他成分一样。110V冰浴电泳，电流基本在10-20mA。电泳完成后切割部分条带进行考染。

出现问题是：我的蛋白都堆积在点样位置，并没有进行迁移。请高手解答，在线等，谢谢！
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1楼 2013-03-05 15:19:56
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-03-05 20:22:05
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-05 20:22:09
是你的蛋白的等电点的问题，我不记得是偏酸还是偏碱的话，就在上样孔那里下不去了。可以尝试：往loading buffer里面加一点SDS，使得SDS在样品中的终浓度为0.0003%，室温放置一会然后上样，这样可以避免电荷对电泳的影响，或者换个缓冲液系统，好像还有另一种缓冲液系统，具体不记得了
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5楼2013-03-05 18:57:10
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普通回帖

Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-03-05 20:21:59
你的是什么样品没给出来。看起来像是标准品？
如果是标准品的话，查查该蛋白等电点。
调整下溶液pH 试试？
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2楼2013-03-05 15:54:00
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Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还有种可能，确保电极没接反么。。。？
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3楼2013-03-05 15:54:54
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xingyel

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能时间太短，非变性跑的慢一些
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4楼2013-03-05 17:21:13
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有个可能，在上样孔那里，有可能是你的蛋白是很大的聚体状态，我的就是这样的，在上样孔那里不下去。聚体太大了，七八百KDa。
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6楼2013-03-05 18:58:38
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-05 18:58:38
还有个可能，在上样孔那里，有可能是你的蛋白是很大的聚体状态，我的就是这样的，在上样孔那里不下去。聚体太大了，七八百KDa。

但是我做的是个预实验，蛋白是已经纯化复性好的。。。
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7楼2013-03-05 19:41:10
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-05 18:57:10
是你的蛋白的等电点的问题，我不记得是偏酸还是偏碱的话，就在上样孔那里下不去了。可以尝试：往loading buffer里面加一点SDS，使得SDS在样品中的终浓度为0.0003%，室温放置一会然后上样，这样可以避免电荷对电泳的 ...

恩，我也认为等电点对native-Page的影响比较大，但是我不知道这个蛋白的信息，没法确定他的等电点，难道还要先去测下等电点么。。。我一直按照酸性蛋白的操作电泳，明天尝试下碱性的。谢谢！
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8楼2013-03-05 19:44:28
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Phyrce

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 麦子绿豆 at 2013-03-05 19:44:28
恩，我也认为等电点对native-Page的影响比较大，但是我不知道这个蛋白的信息，没法确定他的等电点，难道还要先去测下等电点么。。。我一直按照酸性蛋白的操作电泳，明天尝试下碱性的。谢谢！...

如果你知道蛋白序列，即使是名称，也可以到数据库查啊
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9楼2013-03-07 11:54:37
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Ocean_star

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是你的蛋白的等电点与缓冲体系的问题，建议换个缓冲液，再是做Native-PAGE时，可以只用分离胶。
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10楼2013-03-08 09:40:34
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