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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » "6% polyacrylamide sequencing gel"是指什么样的聚丙烯酰胺凝胶？
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jyongchao

木虫 (正式写手)

[求助] "6% polyacrylamide sequencing gel"是指什么样的聚丙烯酰胺凝胶？

如题，"6% polyacrylamide sequencing gel"是指什么样的聚丙烯酰胺凝胶？与一般的聚丙烯酰胺凝胶凝胶有什么不同吗？
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1楼2011-07-21 23:47:18
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
jyongchao(金币+2): 优秀 2011-07-22 09:27:36
西瓜(金币+5): Good！ 2011-07-22 12:18:47
6%聚丙烯酰胺测序胶，现在都没人配制这种胶了吧？
1，蛋白质6%变性PAGE，配制中加入pH6.8的Tris，加了10%的SDS，电泳缓冲液Tris-gly-SDS。
2，非变性PAGE（Native-PAGE），跑DNA。电泳缓冲液TAE、TBE。
3，测序胶：在2的基础上加入7mol/L的尿素。
4，上样缓冲液也有所不同。
5，过硫酸铵和TEMED在DNA凝胶中浓度不随聚丙烯酰胺浓度变化而变化。
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2楼2011-07-22 02:01:20
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
楼上正解；可以配置，也可以购买，多家公司有预制胶出售～比如invitrogen~
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3楼2011-07-22 09:39:41
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jyongchao

木虫 (正式写手)
谢谢指点，不过还有几个问题搞不太清楚
1、能不能把这种胶用的上样缓冲液配方说下呢？找了好几种，不知道是哪个呀。
2、配60ml的胶就要加25.2g尿素，我配的时候尿素不能完全溶解，是不是要用滤纸过滤一下？
3、这应该属于变性聚丙烯酰胺凝胶了吧，DNA加样前都要加热变性？
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4楼2011-07-22 09:42:32
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jyongchao

木虫 (正式写手)
另外，再问个问题：6%的测序胶跑的时候电压要多少呢？先谢谢了
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5楼2011-07-22 12:23:18
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by jyongchao at 2011-07-22 09:42:32:
谢谢指点，不过还有几个问题搞不太清楚
1、能不能把这种胶用的上样缓冲液配方说下呢？找了好几种，不知道是哪个呀。
2、配60ml的胶就要加25.2g尿素，我配的时候尿素不能完全溶解，是不是要用滤纸过滤一下？
3、 ...

楼主试下“引用回复”，这样别人能得到通知哦~
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6楼2011-07-22 17:07:06
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jyongchao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-22 02:01:20:
6%聚丙烯酰胺测序胶，现在都没人配制这种胶了吧？
1，蛋白质6%变性PAGE，配制中加入pH6.8的Tris，加了10%的SDS，电泳缓冲液Tris-gly-SDS。
2，非变性PAGE（Native-PAGE），跑DNA。电泳缓冲液TAE、TBE。
3，测序 ...

谢谢指点，不过还有几个问题搞不太清楚
1、能不能把这种胶用的上样缓冲液配方说下呢？找了好几种，不知道是哪个呀。
2、配60ml的胶就要加25.2g尿素，我配的时候尿素不能完全溶解，是不是要用滤纸过滤一下？
3、这应该属于变性聚丙烯酰胺凝胶了吧，DNA加样前都要加热变性？
4、6%的测序胶跑的时候电压要多少呢？
另外谢谢斑竹提醒撒
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7楼2011-07-22 18:12:29
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gwbk

木虫 (正式写手)
以下资料供你参考：
1，加样缓冲液：
    98%去离子甲酰胺
　　10mol/L EDTA(pH8.0)
　　0.025%二甲苯青FF
　　0.025%溴酚蓝
也有人用6*Loading Buffer的，可能会沉不下去，可以用注射器加样。
2，超声清洗超声加玻璃棒搅拌，或者放微波炉里稍微加热一下，尿素的溶解性很好的。实在有沉底，只能说明尿素不好使，可以用滤纸过滤。如果不放心可以用0.22um的过滤膜过滤。
3，非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化双链DNA片段，变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化单链DNA片段。DNA上样前需要95℃变性2-5min。
4，变性胶电泳时需要高电压、低电流、恒功率以保证条带的分离。如果测序仪电泳的话，1500V~2000V（胶比较长），普通电泳100~200V，也可以放4℃，电压调高一点。有资料恒定功率85W的。
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8楼2011-07-22 22:34:34
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jyongchao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-22 22:34:34:
以下资料供你参考：
1，加样缓冲液：
    98%去离子甲酰胺
　　10mol/L EDTA(pH8.0)
　　0.025%二甲苯青FF
　　0.025%溴酚蓝
也有人用6*Loading Buffer的，可能会沉不下去，可以用注射器加样。
2，超声清洗 ...

谢谢啦！
我查了查资料说尿素溶解的时候应该55度水浴，然后冷却至室温再加其他的东西，我一直不知道就直接加的21g
我们实验室只能做普通电泳，以前见资料上都是几千V的电压，很是吓了一跳啊O(∩_∩)O~
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9楼2011-07-23 01:54:03
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波妞儿
10楼2012-11-26 16:23:40
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