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jyongchao

木虫 (正式写手)

[求助] "6% polyacrylamide sequencing gel"是指什么样的聚丙烯酰胺凝胶?

如题,"6% polyacrylamide sequencing gel"是指什么样的聚丙烯酰胺凝胶?与一般的聚丙烯酰胺凝胶凝胶有什么不同吗?
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
jyongchao(金币+2): 优秀 2011-07-22 09:27:36
西瓜(金币+5): Good! 2011-07-22 12:18:47
6%聚丙烯酰胺测序胶,现在都没人配制这种胶了吧?
1,蛋白质6%变性PAGE,配制中加入pH6.8的Tris,加了10%的SDS,电泳缓冲液Tris-gly-SDS。
2,非变性PAGE(Native-PAGE),跑DNA。电泳缓冲液TAE、TBE。
3,测序胶:在2的基础上加入7mol/L的尿素。
4,上样缓冲液也有所不同。
5,过硫酸铵和TEMED在DNA凝胶中浓度不随聚丙烯酰胺浓度变化而变化。
2楼2011-07-22 02:01:20
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

楼上正解;可以配置,也可以购买,多家公司有预制胶出售~比如invitrogen~
3楼2011-07-22 09:39:41
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jyongchao

木虫 (正式写手)

谢谢指点,不过还有几个问题搞不太清楚
1、能不能把这种胶用的上样缓冲液配方说下呢?找了好几种,不知道是哪个呀。
2、配60ml的胶就要加25.2g尿素,我配的时候尿素不能完全溶解,是不是要用滤纸过滤一下?
3、这应该属于变性聚丙烯酰胺凝胶了吧,DNA加样前都要加热变性?
4楼2011-07-22 09:42:32
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jyongchao

木虫 (正式写手)

另外,再问个问题:6%的测序胶跑的时候电压要多少呢?先谢谢了
5楼2011-07-22 12:23:18
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

引用回帖:
Originally posted by jyongchao at 2011-07-22 09:42:32:
谢谢指点,不过还有几个问题搞不太清楚
1、能不能把这种胶用的上样缓冲液配方说下呢?找了好几种,不知道是哪个呀。
2、配60ml的胶就要加25.2g尿素,我配的时候尿素不能完全溶解,是不是要用滤纸过滤一下?
3、 ...

楼主试下“引用回复”,这样别人能得到通知哦~
6楼2011-07-22 17:07:06
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jyongchao

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-22 02:01:20:
6%聚丙烯酰胺测序胶,现在都没人配制这种胶了吧?
1,蛋白质6%变性PAGE,配制中加入pH6.8的Tris,加了10%的SDS,电泳缓冲液Tris-gly-SDS。
2,非变性PAGE(Native-PAGE),跑DNA。电泳缓冲液TAE、TBE。
3,测序 ...

谢谢指点,不过还有几个问题搞不太清楚
1、能不能把这种胶用的上样缓冲液配方说下呢?找了好几种,不知道是哪个呀。
2、配60ml的胶就要加25.2g尿素,我配的时候尿素不能完全溶解,是不是要用滤纸过滤一下?
3、这应该属于变性聚丙烯酰胺凝胶了吧,DNA加样前都要加热变性?
4、6%的测序胶跑的时候电压要多少呢?
另外谢谢斑竹提醒撒
7楼2011-07-22 18:12:29
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gwbk

木虫 (正式写手)

以下资料供你参考:
1,加样缓冲液:
    98%去离子甲酰胺
  10mol/L EDTA(pH8.0)
  0.025%二甲苯青FF
  0.025%溴酚蓝
也有人用6*Loading Buffer的,可能会沉不下去,可以用注射器加样。
2,超声清洗超声加玻璃棒搅拌,或者放微波炉里稍微加热一下,尿素的溶解性很好的。实在有沉底,只能说明尿素不好使,可以用滤纸过滤。如果不放心可以用0.22um的过滤膜过滤。
3,非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化双链DNA片段,变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化单链DNA片段。DNA上样前需要95℃变性2-5min。
4,变性胶电泳时需要高电压、低电流、恒功率以保证条带的分离。如果测序仪电泳的话,1500V~2000V(胶比较长),普通电泳100~200V,也可以放4℃,电压调高一点。有资料恒定功率85W的。
8楼2011-07-22 22:34:34
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jyongchao

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by gwbk at 2011-07-22 22:34:34:
以下资料供你参考:
1,加样缓冲液:
    98%去离子甲酰胺
  10mol/L EDTA(pH8.0)
  0.025%二甲苯青FF
  0.025%溴酚蓝
也有人用6*Loading Buffer的,可能会沉不下去,可以用注射器加样。
2,超声清洗 ...

谢谢啦!
我查了查资料说尿素溶解的时候应该55度水浴,然后冷却至室温再加其他的东西,我一直不知道就直接加的21g
我们实验室只能做普通电泳,以前见资料上都是几千V的电压,很是吓了一跳啊O(∩_∩)O~
9楼2011-07-23 01:54:03
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10楼2012-11-26 16:23:40
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