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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核蛋白表达几个疑问

最近本人在做蛋白原核表达,有些疑问一直没弄明白!
1.IPTG诱导蛋白后,什么情况是直接加裂解液离心后加上样缓冲液跑SDS-PAGE?什么情况需要超声后离心跑电泳呢?
2.尿素是什么时候用?加在哪里的呢?
3.细胞裂解液自己配的,丁香园查的配方有几种版本,有的加SDS,有的加吐温,有的只是Tris-hcl,nacl,这些,要怎么选择呢?
做了这么久western blot一直没搞懂这些问题!
希望高手指点!
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秋水素心

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
IPTG诱导表达的蛋白加裂解液后一般还是需要超声裂解的,没见过不超声的。
尿素溶液促进蛋白质变性,如果表达的蛋白非可溶蛋白,裂解后加入一定浓度尿素溶液,可以使沉淀蛋白溶解,用于蛋白纯化等后续步骤。若是可溶性蛋白,应该是用不上的。
无论是SDS,还是吐温都是去污剂,区别在于你要去污的类型,至于主要用什么,我不是很清楚。
认真过好每一天!
2楼2013-02-28 20:53:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果你要看IPTG是否能诱导出目的蛋白,可以直接收集菌体后加SDS上样buffer后跑胶。因为SDS上样buffer本身能裂解细菌,不用超声,得到的样品是细菌总蛋白。
超声是为了得到可溶的活性蛋白。确定IPTG诱导成功后要确定目的蛋白是以可溶形式存在的还是在包涵体里面。是用不含SDS的裂解液,超声后离心取上清得到可溶蛋白,然后取总蛋白、可溶蛋白、沉淀三个样品跑SDS-PAGE。
尿素是为了把包涵体中的变性蛋白复性时用的。
细胞裂解液的成分要根据不同的目的配制。
3楼2013-03-01 00:58:01
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