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qinhuan0425

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核蛋白表达几个疑问

最近本人在做蛋白原核表达，有些疑问一直没弄明白！
1.IPTG诱导蛋白后，什么情况是直接加裂解液离心后加上样缓冲液跑SDS-PAGE？什么情况需要超声后离心跑电泳呢？
2.尿素是什么时候用？加在哪里的呢？
3.细胞裂解液自己配的，丁香园查的配方有几种版本，有的加SDS,有的加吐温，有的只是Tris-hcl，nacl,这些，要怎么选择呢？
做了这么久western blot一直没搞懂这些问题！
希望高手指点！
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1楼 2013-02-28 20:38:09
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秋水素心

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
IPTG诱导表达的蛋白加裂解液后一般还是需要超声裂解的，没见过不超声的。
尿素溶液促进蛋白质变性，如果表达的蛋白非可溶蛋白，裂解后加入一定浓度尿素溶液，可以使沉淀蛋白溶解，用于蛋白纯化等后续步骤。若是可溶性蛋白，应该是用不上的。
无论是SDS，还是吐温都是去污剂，区别在于你要去污的类型，至于主要用什么，我不是很清楚。
赞一下 回复此楼
认真过好每一天！
2楼2013-02-28 20:53:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果你要看IPTG是否能诱导出目的蛋白，可以直接收集菌体后加SDS上样buffer后跑胶。因为SDS上样buffer本身能裂解细菌，不用超声，得到的样品是细菌总蛋白。
超声是为了得到可溶的活性蛋白。确定IPTG诱导成功后要确定目的蛋白是以可溶形式存在的还是在包涵体里面。是用不含SDS的裂解液，超声后离心取上清得到可溶蛋白，然后取总蛋白、可溶蛋白、沉淀三个样品跑SDS-PAGE。
尿素是为了把包涵体中的变性蛋白复性时用的。
细胞裂解液的成分要根据不同的目的配制。
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3楼2013-03-01 00:58:01
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