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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何在切胶回收的DNA片段两端添加P32标记呢？
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mangmanglulu

金虫 (小有名气)

[交流] 如何在切胶回收的DNA片段两端添加P32标记呢？ 已有1人参与

如何在切胶回收的DNA片段两端添加P32标记呢？有没有相关的试剂盒？？请大家不吝指教，谢谢
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1楼 2013-02-26 13:39:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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mangmanglulu: 回帖置顶 2013-02-27 10:06:41
如果是PCR产物或者合成的oligo直接用T4 polynucleotide kinase，底物用γ-32P ATP。如果DNA片段本身带5’P的话，需要先去磷酸化，然后再做标记。
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2楼2013-02-26 14:13:36
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mangmanglulu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-26 14:13:36
如果是PCR产物或者合成的oligo直接用T4 polynucleotide kinase，底物用γ-32P ATP。如果DNA片段本身带5’P的话，需要先去磷酸化，然后再做标记。

用这个T4 PNK是不是还得购买一些γ-32P ATP？
我是想在我回收的PCR产物末端添加标记，如何确定就您说的那个DNA片段本身是否带5‘P呢？
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3楼2013-02-27 09:57:30
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mangmanglulu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-26 14:13:36
如果是PCR产物或者合成的oligo直接用T4 polynucleotide kinase，底物用γ-32P ATP。如果DNA片段本身带5’P的话，需要先去磷酸化，然后再做标记。

另我还想问一下 那个放射性同位素标记对实验室有没有一定的要求啊？我看有的说用生物素等非同位素标记，我接下来准备做凝胶迁移，能行吗？
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4楼2013-02-27 10:19:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by mangmanglulu at 2013-02-27 09:57:30
用这个T4 PNK是不是还得购买一些γ-32P ATP？
我是想在我回收的PCR产物末端添加标记，如何确定就您说的那个DNA片段本身是否带5‘P呢？...

T4 PNK只是kinase，底物要自己买。PCR产物一般是没有5'P的，因为合成的引物不特别要求的话是不带有磷酸基团的。所以PCR产物可以直接标记。
另外，如果做放射性同位素实验的确对实验室和操作有一些要求。可以用生物素标记代替进一步做gel shift实验。
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5楼2013-02-27 11:11:01
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mangmanglulu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-27 11:11:01
T4 PNK只是kinase，底物要自己买。PCR产物一般是没有5'P的，因为合成的引物不特别要求的话是不带有磷酸基团的。所以PCR产物可以直接标记。
另外，如果做放射性同位素实验的确对实验室和操作有一些要求。可以用生物 ...

非常感谢您的帮助，非常感谢！
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6楼2013-02-27 16:02:52
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