| 查看: 3656 | 回复: 23 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
liangjuan2007铜虫 (小有名气)
|
[求助]
双抗体夹心ELISA的梯度浓度标准品实验结果确无梯度变化，真心求大家帮忙分析原因！
|
|
|
最近做双抗体夹心ELISA，一抗二抗用的都是进口的，之前做WB试验的，标准品是sigma公司的冻干粉，买回来自己配的不同的梯度浓度，最后标准品的实验结果却没有梯度变化，数据几乎完全一样，到底是为什么啊！ 我配置的标准品的浓度如下：(U/L) 200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、 相应的OD值结果：2.564、2.617、2.719、2.657、2.712、2.835、2.646、 空白孔的值也大的吓人，为:2.697. 做了好多次结果都是这样，一抗稀释度做过1:2000、1:4000、1:6000，二抗做过1:4000、1:8000、1:16000的，完全没有梯度，这是为什么啊为什么啊？ 我具体的实验步骤如下： (1)包被：用包被缓冲液将一抗稀释成一定浓度。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。 (2)封闭：封闭液（5%的脱脂奶粉）每孔0.2ml，37℃，2h后洗涤。（尝试过封闭和不封闭的，结果没有差别） (3)加样：加一定浓度稀释（封闭液稀释）的标准品溶液(同时做空白对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37℃， 1 hr。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。 (4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（封闭液稀释）0.1ml。37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板6 次，每次3 min。（怕洗不干净，加倍次数，据说这步的洗涤很重要！） (5)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。（TMB用的是生工的粉末，然后自己配的） (6)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。 (7)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm读数。 都快抑郁了，跪求各位前辈给点意见吧！ |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
xiaopitian» 猜你喜欢
26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂
已经有4人回复
-
286求调剂
已经有5人回复
-
材料与化工（0856）304求 B区 调剂
已经有3人回复
-
268求调剂
已经有8人回复
-
265求调剂
已经有14人回复
-
350 本科985求调剂，求老登收留
已经有3人回复
-
【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂
已经有9人回复
-
初试 317
已经有3人回复
-
279分求调剂 一志愿211
已经有15人回复
-
279求调剂
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 双抗夹心ELISA灵敏度
已经有28人回复
- 双抗夹心ELISA 重组抗原严重吸附到板上，怎么解？
已经有6人回复
- 双抗夹心ELISA，怎么鉴定酶标抗体？
已经有10人回复
- 双抗体夹心包被人多抗血清可行吗？
已经有0人回复
- 夹心ELISA方法的建立及酶标单抗
已经有17人回复
- 夹心ELISA几种包被液尝试出现的问题
已经有4人回复
- 双抗体夹心ELISA，阳性孔，样品孔和阴性对照全部不显色，怎么回事
已经有12人回复
- 双抗体夹心ELISA，阴性值很高，怎么回事呢
已经有41人回复
- 有关双抗夹心ELISA测IgG的问题
已经有0人回复
- ELISA中双抗体夹心法中标准物浓度问题
已经有3人回复
- 间接Elisa检测与双抗体夹心Elisa检测结果不一致
已经有13人回复
- 【求助/交流】双抗体夹心ELISA的空白孔该怎么设置？
已经有6人回复
- 【求助/交流】双抗体夹心ELISA，样品太珍贵怎么办？
已经有1人回复
- 【求助/交流】双抗体夹心ELISA遇到的问题
已经有3人回复
- 【分享】ELISA法测定单克隆抗体的效价
已经有7人回复
conanzzz
木虫 (正式写手)
- 应助: 76 (初中生)
- 金币: 4633.5
- 散金: 248
- 红花: 5
- 帖子: 524
- 在线: 383小时
- 虫号: 818114
- 注册: 2009-07-29
- 专业: 细胞生物学研究中的新方法
5楼2013-02-26 11:38:35
xiaoqi5992
银虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 42 (小学生)
- 金币: 552.9
- 红花: 2
- 帖子: 407
- 在线: 187小时
- 虫号: 631148
- 注册: 2008-10-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2013-02-25 16:27:46
liangjuan2007
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 237.1
- 红花: 2
- 帖子: 171
- 在线: 72.1小时
- 虫号: 485657
- 注册: 2007-12-27
- 性别: MM
- 专业: 食品科学基础
3楼2013-02-25 16:36:22
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析，欢迎交流 2013-02-27 05:42:31
liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:30:51
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析，欢迎交流 2013-02-27 05:42:31
liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:30:51
看完你的结果后，首先感觉空白结果很奇怪，按道理，它是不应该出现颜色的，但是现在，他的结果和你梯度实验的结果无差异，由此分析，我觉得问题最大的可能性是出在TMB上，你可以试着检查一下TMB是否有问题，或者用一些商品化的TMB。第二个感觉可能有问题的是洗液，只有此两项影响你的整个实验，导致可能出现问题；以上是我的建议，希望对你有帮助。呵呵！祝你实验顺利。 |
4楼2013-02-26 11:27:52
10