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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双抗体夹心ELISA的梯度浓度标准品实验结果确无梯度变化，真心求大家帮忙分析原因！
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liangjuan2007

铜虫 (小有名气)

[求助] 双抗体夹心ELISA的梯度浓度标准品实验结果确无梯度变化，真心求大家帮忙分析原因！

最近做双抗体夹心ELISA，一抗二抗用的都是进口的，之前做WB试验的，标准品是sigma公司的冻干粉，买回来自己配的不同的梯度浓度，最后标准品的实验结果却没有梯度变化，数据几乎完全一样，到底是为什么啊！
我配置的标准品的浓度如下：(U/L) 200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、
相应的OD值结果：2.564、2.617、2.719、2.657、2.712、2.835、2.646、   
空白孔的值也大的吓人，为:2.697.
做了好多次结果都是这样，一抗稀释度做过1:2000、1:4000、1:6000，二抗做过1:4000、1:8000、1:16000的，完全没有梯度，这是为什么啊为什么啊？
我具体的实验步骤如下：
(1)包被：用包被缓冲液将一抗稀释成一定浓度。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(2)封闭：封闭液（5%的脱脂奶粉）每孔0.2ml，37℃，2h后洗涤。（尝试过封闭和不封闭的，结果没有差别）
(3)加样：加一定浓度稀释（封闭液稀释）的标准品溶液(同时做空白对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37℃， 1 hr。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
(4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（封闭液稀释）0.1ml。37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板6 次，每次3 min。（怕洗不干净，加倍次数，据说这步的洗涤很重要！）
(5)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。（TMB用的是生工的粉末，然后自己配的）
(6)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。
(7)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm读数。
都快抑郁了，跪求各位前辈给点意见吧！
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1楼2013-02-25 14:50:53
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xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-02-25 20:07:32
liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:30:06
空白孔出现这么高的OD确实有点异常，不知道你空白孔是怎么做的；
你的标准品是不是稀释的浓度太高，都处在了平台期啊，建议你把标准品在往下多稀释一些梯度，找到你的曲线的线性范围。
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2楼2013-02-25 16:27:46
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liangjuan2007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2013-02-25 16:27:46
空白孔出现这么高的OD确实有点异常，不知道你空白孔是怎么做的；
你的标准品是不是稀释的浓度太高，都处在了平台期啊，建议你把标准品在往下多稀释一些梯度，找到你的曲线的线性范围。

非常感谢！空白孔就是不加标准品，直接加稀释液也就是封闭液
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3楼2013-02-25 16:36:22
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小小豆豆

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析，欢迎交流 2013-02-27 05:42:31
liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:30:51
看完你的结果后，首先感觉空白结果很奇怪，按道理，它是不应该出现颜色的，但是现在，他的结果和你梯度实验的结果无差异，由此分析，我觉得问题最大的可能性是出在TMB上，你可以试着检查一下TMB是否有问题，或者用一些商品化的TMB。第二个感觉可能有问题的是洗液，只有此两项影响你的整个实验，导致可能出现问题；以上是我的建议，希望对你有帮助。呵呵！祝你实验顺利。
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4楼2013-02-26 11:27:52
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conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-02-27 05:42:49
liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:31:09
LZ你的空白是不是一抗二抗都有?有没有可能二抗的非特异性吸附太强了?
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5楼2013-02-26 11:38:35
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liangjuan2007

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by conanzzz at 2013-02-26 11:38:35
LZ你的空白是不是一抗二抗都有?有没有可能二抗的非特异性吸附太强了?

空白是一抗二抗都有的，但没有加抗原；我尝试过不包被一抗且不加标准品抗原的，只加二抗的，它的OD值就只有0.04了！跟干净的孔（没做试验的）读数一样。
二抗的稀释度做过不一样的，结果没有大差别，难道是稀释度还不够？感觉已经很大了，都到1:16000了？
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6楼2013-02-26 18:25:08
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小小豆豆

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:31:20
空白是一抗二抗都有的，但没有加抗原；我尝试过不包被一抗且不加标准品抗原的，只加二抗的，它的OD值就只有0.04了！跟干净的孔（没做试验的）读数一样。
二抗的稀释度做过不一样的，结果没有大差别，难道是稀释度还不够？感觉已经很大了，都到1:16000了？

做过只加二抗，它的OD值就只有0.04，那TMB就无问题，洗液也无问题，那可能性就出在酶标二抗可能被吸附产生的结果了，你把稀释液更换一下，别用封闭液稀释，换用血清或白蛋白（BSA）做稀释液试一下。呵呵
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7楼2013-02-27 09:24:02
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ywhcsy

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:31:26
同意7楼意见
应该是酶标二抗与封闭液的脱脂奶粉有非特异性结合，不知道楼主有没有做空白封闭后加入酶标二抗，看看有多少的信号值
尝试换成BSA封闭也许可以解决
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do what you think is right
8楼2013-02-27 09:39:10
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liangjuan2007

铜虫 (小有名气)
liangjuan2007: 回帖置顶 2013-03-04 08:08:17
liangjuan2007: 取消置顶 2013-03-04 08:26:38
引用回帖:
8楼: Originally posted by ywhcsy at 2013-02-27 09:39:10
同意7楼意见
应该是酶标二抗与封闭液的脱脂奶粉有非特异性结合，不知道楼主有没有做空白封闭后加入酶标二抗，看看有多少的信号值
尝试换成BSA封闭也许可以解决

昨天用0.1%BSA做稀释液代替脱脂奶粉试了一下，结果还是没有梯度，这到底是肿么了？
其余条件步骤一样，就加的抗原不同，分别是加七个不同梯度浓度的标准品和加稀释液及包被液，这些孔的蓝色都一样，没有梯度！
而不包被一抗和不加抗原，只加二抗的则没有显色！
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9楼2013-03-02 16:53:52
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liangjuan2007

铜虫 (小有名气)
最后显色时呈现暗绿色，这是什么情况？
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10楼2013-03-08 15:57:58
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