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liangjuan2007铜虫 (小有名气)
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双抗体夹心ELISA的梯度浓度标准品实验结果确无梯度变化，真心求大家帮忙分析原因！
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最近做双抗体夹心ELISA，一抗二抗用的都是进口的，之前做WB试验的，标准品是sigma公司的冻干粉，买回来自己配的不同的梯度浓度，最后标准品的实验结果却没有梯度变化，数据几乎完全一样，到底是为什么啊！ 我配置的标准品的浓度如下：(U/L) 200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、 相应的OD值结果：2.564、2.617、2.719、2.657、2.712、2.835、2.646、 空白孔的值也大的吓人，为:2.697. 做了好多次结果都是这样，一抗稀释度做过1:2000、1:4000、1:6000，二抗做过1:4000、1:8000、1:16000的，完全没有梯度，这是为什么啊为什么啊？ 我具体的实验步骤如下： (1)包被：用包被缓冲液将一抗稀释成一定浓度。在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。 (2)封闭：封闭液（5%的脱脂奶粉）每孔0.2ml，37℃，2h后洗涤。（尝试过封闭和不封闭的，结果没有差别） (3)加样：加一定浓度稀释（封闭液稀释）的标准品溶液(同时做空白对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37℃， 1 hr。用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。 (4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（封闭液稀释）0.1ml。37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板6 次，每次3 min。（怕洗不干净，加倍次数，据说这步的洗涤很重要！） (5)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。（TMB用的是生工的粉末，然后自己配的） (6)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。 (7)结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm读数。 都快抑郁了，跪求各位前辈给点意见吧！ |
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liangjuan2007
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liangjuan2007: 金币+1, ★有帮助 2013-02-27 14:30:51
看完你的结果后，首先感觉空白结果很奇怪，按道理，它是不应该出现颜色的，但是现在，他的结果和你梯度实验的结果无差异，由此分析，我觉得问题最大的可能性是出在TMB上，你可以试着检查一下TMB是否有问题，或者用一些商品化的TMB。第二个感觉可能有问题的是洗液，只有此两项影响你的整个实验，导致可能出现问题；以上是我的建议，希望对你有帮助。呵呵！祝你实验顺利。 |
4楼2013-02-26 11:27:52
conanzzz
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