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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA甲基化实验中的疑惑
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农田耕者

金虫 (小有名气)

[求助] DNA甲基化实验中的疑惑 已有1人参与

最近一直在做种子的甲基化，从种子胚中提取的DNA，质量和浓度都还不错，260/280和260/230均在1.9-2.0之间，浓度2000μg/L，酶切用的是ECORI和HPAII（快酶），连接、预扩、选扩，效果一直不是很满意，聚丙烯酰胺凝胶电泳的效果不是很好，时而可以跑出条带，时而弥散一片。
有几个问题：1、酶切后用不用纯化，如果不纯化，连接接头的时候容易吗？连接后如何检测是否连接上了？2、有没有做过DNA甲基化分析的高手（MSAP），求各个步骤的体系？3、在这个实验过程中，最经常出现的问题是什么？
先谢谢各位高手了
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还行
1楼 2013-01-20 16:07:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

水中小妖

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-18 08:24:52
我做过MSAP，给我的感觉是每一步都非常重要，第一次做的时候每一步一定要检测！而且一定要注意各个接头、酶的浓度，还有连接产物的用量和预扩产物的稀释倍数！如果稀释倍数过小的话，上板跑也会是一片弥散。
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路漫漫其修远，吾将上下而求索~
6楼2013-04-17 22:49:16
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闹闹女巫

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-18 08:24:38
请问您用的内切酶是哪个公司的？我也在做MSAP   最后条带弥散一片  可能是你的DNA破坏了 也就是说DNA断掉了  以至于部分接头没接上  检测到的是接头片段  及短的DNA
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3楼2013-02-27 13:06:14
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胡凯凤

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 水中小妖 at 2013-04-17 22:49:16
我做过MSAP，给我的感觉是每一步都非常重要，第一次做的时候每一步一定要检测！而且一定要注意各个接头、酶的浓度，还有连接产物的用量和预扩产物的稀释倍数！如果稀释倍数过小的话，上板跑也会是一片弥散。

想请问你 有没有具体的浓度，及预扩， 选扩稀释倍数呀   我都做了好几个月了 也出不来~能不能帮帮忙啊
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8楼2014-03-04 16:25:52
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普通回帖

lnsbsmillet

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-18 08:24:29
1 最好不要纯化，会对DNA产生影响
2 如果有材料可以重新提一下DNA，重新连接、、、、、、，如果还不行，可能就是酶的毛病了，重新稀释一下。
做分子实验必须认真，每个环节都很重要，否则，不容易成功。
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2楼2013-02-01 21:40:40
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ADTechnology

捐助贵宾 (著名写手)

表观遗传学专业供应商

【答案】应助回帖

您甲基化的盒子使用的是那个公司的呢？
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4楼2013-04-17 21:01:17
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农田耕者

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ADTechnology at 2013-04-17 21:01:17
您甲基化的盒子使用的是那个公司的呢？

没用盒子，全是自己配的试剂，买的内切酶，fastdigest
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还行
5楼2013-04-17 21:18:37
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tyh126

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-30 18:05:53
酶切后不用纯化，连接后检测是否连接上了用电泳
各个步骤的体系在西瓜的文献里有i查查
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7楼2013-08-30 17:31:34
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胡凯凤

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 水中小妖 at 2013-04-17 22:49:16
我做过MSAP，给我的感觉是每一步都非常重要，第一次做的时候每一步一定要检测！而且一定要注意各个接头、酶的浓度，还有连接产物的用量和预扩产物的稀释倍数！如果稀释倍数过小的话，上板跑也会是一片弥散。

你有没有具体的稀释倍数？
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9楼2014-03-04 16:29:00
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yz2007433052

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

methods in molecular biology 里边有一个DNA methylation的专题，我觉得里边有一篇好像是讲酶切后纯化的
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激浪青春！
10楼2015-03-07 09:27:56
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