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农田耕者

金虫 (小有名气)

[求助] DNA甲基化实验中的疑惑 已有1人参与

最近一直在做种子的甲基化,从种子胚中提取的DNA,质量和浓度都还不错,260/280和260/230均在1.9-2.0之间,浓度2000μg/L,酶切用的是ECORI和HPAII(快酶),连接、预扩、选扩,效果一直不是很满意,聚丙烯酰胺凝胶电泳的效果不是很好,时而可以跑出条带,时而弥散一片。
有几个问题:1、酶切后用不用纯化,如果不纯化,连接接头的时候容易吗?连接后如何检测是否连接上了?2、有没有做过DNA甲基化分析的高手(MSAP),求各个步骤的体系?3、在这个实验过程中,最经常出现的问题是什么?
先谢谢各位高手了
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水中小妖

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-18 08:24:52
我做过MSAP,给我的感觉是每一步都非常重要,第一次做的时候每一步一定要检测!而且一定要注意各个接头、酶的浓度,还有连接产物的用量和预扩产物的稀释倍数!如果稀释倍数过小的话,上板跑也会是一片弥散。
路漫漫其修远,吾将上下而求索~
6楼2013-04-17 22:49:16
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闹闹女巫

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-18 08:24:38
请问您用的内切酶是哪个公司的?我也在做MSAP   最后条带弥散一片  可能是你的DNA破坏了 也就是说DNA断掉了  以至于部分接头没接上  检测到的是接头片段  及短的DNA
3楼2013-02-27 13:06:14
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胡凯凤

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 水中小妖 at 2013-04-17 22:49:16
我做过MSAP,给我的感觉是每一步都非常重要,第一次做的时候每一步一定要检测!而且一定要注意各个接头、酶的浓度,还有连接产物的用量和预扩产物的稀释倍数!如果稀释倍数过小的话,上板跑也会是一片弥散。

想请问你 有没有具体的浓度,及预扩, 选扩稀释倍数呀   我都做了好几个月了 也出不来~能不能帮帮忙啊
8楼2014-03-04 16:25:52
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普通回帖

lnsbsmillet

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-18 08:24:29
1 最好不要纯化,会对DNA产生影响
2 如果有材料可以重新提一下DNA,重新连接、、、、、、,如果还不行,可能就是酶的毛病了,重新稀释一下。
做分子实验必须认真,每个环节都很重要,否则,不容易成功。
2楼2013-02-01 21:40:40
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ADTechnology

捐助贵宾 (著名写手)

表观遗传学专业供应商


【答案】应助回帖

您甲基化的盒子使用的是那个公司的呢?
4楼2013-04-17 21:01:17
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农田耕者

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ADTechnology at 2013-04-17 21:01:17
您甲基化的盒子使用的是那个公司的呢?

没用盒子,全是自己配的试剂,买的内切酶,fastdigest
还行
5楼2013-04-17 21:18:37
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tyh126

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-30 18:05:53
酶切后不用纯化,连接后检测是否连接上了用电泳
各个步骤的体系在西瓜的文献里有i查查
7楼2013-08-30 17:31:34
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胡凯凤

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 水中小妖 at 2013-04-17 22:49:16
我做过MSAP,给我的感觉是每一步都非常重要,第一次做的时候每一步一定要检测!而且一定要注意各个接头、酶的浓度,还有连接产物的用量和预扩产物的稀释倍数!如果稀释倍数过小的话,上板跑也会是一片弥散。

你有没有具体的稀释倍数?
9楼2014-03-04 16:29:00
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yz2007433052

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

methods in molecular biology 里边有一个DNA methylation的专题,我觉得里边有一篇好像是讲酶切后纯化的
激浪青春!
10楼2015-03-07 09:27:56
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