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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Trizol 法 RNA提取失败 请虫友帮忙分析下 什么原因?该怎么办吖
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cai3110274

木虫 (职业作家)

[求助] Trizol 法 RNA提取失败 请虫友帮忙分析下 什么原因?该怎么办吖

A260/A280=2.05   A260/A230=2.3   浓度1000ng/μL
电泳跑出来怎么会这样呢  ？
还有一个情况是 我的Trizol试剂是红色的  加氯仿  离心分 三层取上清的 时候  我的上层怎么还是红色的呢  没有无色 有没有知道的 帮忙指点一下 非常着急！ 感谢！
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夫天地者万物之逆旅
1楼2013-01-17 10:49:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cai3110274: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-17 17:36:48
胶放反了。下面那些亮的是RNA，5S分开成条带，两条大的没分开。上样量是不是有些大了。点样孔有些亮，说明有蛋白核酸复合体。
trizol加入氯仿抽提离心后应该在下面的有机相里。这一步混合一定要充分，使氯仿充分萃取trizol试剂里的有机成分。你说的上面水相还是红的有可能是氯仿萃取不充分。一般在材料使用较多时水相会有一点颜色，那是材料萝莉的水溶性色素。如果你的材料不是含有大量水溶性红色素而水相颜色很红的话，那是有问题。一个是注意氯仿抽提充分，另一个可能是氯仿加的体积不对。
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3楼2013-01-17 12:01:26
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cai3110274: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢 2013-01-22 21:42:20
从12楼的胶图看RNA的质量很高，现在测OD260,280.和230，若260/280在1.9-2.1之间就很好，且260/230在2以上就说明没有巯基乙醇、乙醇和trizol的污染
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13楼2013-01-19 21:42:51
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yuhanjie0205

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有比较严重的DNA污染，建议少一些细胞，Trizol多匀浆一会，匀浆后导入离心管静止15-20min，离心取上清加氯仿后用手使劲摇。个人感觉涡旋力度不太够，我一般都是用手摇。
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14楼2013-01-20 00:01:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
cai3110274: 金币+3, ★★★很有帮助, 感谢你的耐心指导 2013-01-20 10:12:31
引用回帖:
12楼: Originally posted by cai3110274 at 2013-01-19 20:30:37
麻烦帮我看一下 这是我新提的RNA  算合格吗？

10000349584316.jpg
...

新提的这次应该是不错。虽说电泳有拖尾，不过看你的marker也有些问题，可能是电泳时间有些长。跑RNA最好不要跑太久，否则电泳时也会造成降解。
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15楼2013-01-20 01:29:09
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普通回帖

cai3110274

木虫 (职业作家)
RNA 电泳图

10000652649544.jpg
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夫天地者万物之逆旅
2楼2013-01-17 10:56:04
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淘气肥猫

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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cai3110274: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-01-17 17:42:34
5S的带有点太亮了，可能有些降解。还有你的Trizol加的可能不够多，不能完全裂解样品，所以水相里的颜色来自未被充分裂解的样品，可能是血啊或者花青素啊什么的。还有再确定一下你的trizol和氯仿质量没问题吧
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4楼2013-01-17 13:35:42
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cai3110274

木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-17 12:01:26
胶放反了。下面那些亮的是RNA，5S分开成条带，两条大的没分开。上样量是不是有些大了。点样孔有些亮，说明有蛋白核酸复合体。
trizol加入氯仿抽提离心后应该在下面的有机相里。这一步混合一定要充分，使氯仿充分萃 ...

我的材料就是酵母细胞  用液氮研磨后加进1ml的trizol里的   氯仿我加200μl，应该是对的吧。难道是我混合的不均匀，涡旋15秒 可以吗？还是我细胞的量加的多了？  怎么鉴定氯仿是好的还是有问题的？
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夫天地者万物之逆旅
5楼2013-01-17 17:41:57
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cai3110274

木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 淘气肥猫 at 2013-01-17 13:35:42
5S的带有点太亮了，可能有些降解。还有你的Trizol加的可能不够多，不能完全裂解样品，所以水相里的颜色来自未被充分裂解的样品，可能是血啊或者花青素啊什么的。还有再确定一下你的trizol和氯仿质量没问题吧

你好，我的是酵母细胞 应该没有什么色素，怎么确定氯仿的质量呢？trizol应该没有什么问题
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夫天地者万物之逆旅
6楼2013-01-17 17:43:30
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淘气肥猫

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

直接开一瓶新氯仿好了
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7楼2013-01-17 19:16:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
cai3110274: 金币+6, ★★★★★最佳答案, 恩 我重新试验了一下 减少了细胞的量 混匀更剧烈了点 可以了 非常感谢 2013-01-19 20:21:52
引用回帖:
5楼: Originally posted by cai3110274 at 2013-01-17 17:41:57
我的材料就是酵母细胞  用液氮研磨后加进1ml的trizol里的   氯仿我加200μl，应该是对的吧。难道是我混合的不均匀，涡旋15秒 可以吗？还是我细胞的量加的多了？  怎么鉴定氯仿是好的还是有问题的？...

可能是细胞加多了。混匀我一般也没有注意时间，大概是2×15秒吧。氯仿的疏水性更强，主要作用是抽提TRIZOL里面的酚，加速分层。氯仿一般不会有问题吧。
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8楼2013-01-18 07:36:15
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hejp03

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cai3110274: 金币+5, ★★★很有帮助, 恩 感谢指导 确实可能细胞多了 TRIZOl对细胞量要求还真严格 2013-01-19 20:22:47
条带有降解。确定是跑胶的原因，还是提取的原因。操作步骤应该没问题，看条带那么亮，可以少用些细胞或者多加些Trizol。
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9楼2013-01-18 08:37:45
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cai3110274: 金币+3, ★★★很有帮助, 确实用的了蛮久了 不过还可以用 呵呵 2013-01-19 20:23:52
不是你的水饱和酚有问题就是氯仿有问题
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10楼2013-01-19 01:51:12
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