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挑战者001

银虫 (小有名气)

[求助] 如何硫酸铵的沉淀的浓度啊

我想将发酵液中的蛋白酶提取出来,此前师兄做的此酶的等电点为5.75,最适温度为40℃,最适pH为7.0,Ca2+对酶活有较为明显的提高, Fe2+、Co2+、Ni2+对酶活有降低的作用。        我不知如何设计硫酸铵的分级沉淀,如何确定最适硫酸铵浓度??以及注意事项??  谢谢。新手十分感激不尽。
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daodao8657

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
挑战者001: 金币+5 2012-12-22 18:50:46
硫酸铵分级沉淀:将粗酶液在冰浴条件下缓慢加入固体硫酸铵至饱和度20%。4 ℃下静置30 min,离心收集沉淀,用少量缓冲液溶解。接着以每间隔10%的饱和度往上清液中加入固体硫酸铵,4 ℃下静置30 min后离心收集沉淀,用少量缓冲液溶解,即得到酶蛋白盐析液。重复上述步骤。直至硫酸铵饱和度加至80%。测定各饱和度阶段所沉淀的蛋白质含量和蛋白酶活性,并计算比活力
一般蛋白在10%饱和度下极少会析出,所以直接将饱和度增至20%
3楼2012-12-22 15:17:33
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virty76

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
挑战者001: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-12-22 10:28:19
硫酸铵盐沉淀,一般蛋白在80%的饱和盐浓度下均可析出(除非初始浓度太低)
主要关注目标蛋白与杂蛋白之间的盐沉淀差异,分级沉淀去除部分杂蛋白。
注意蛋白液预冷,防止盐沉淀过程发热。
沉淀现象需要一定时间,可在冰箱过夜。
2楼2012-12-22 08:45:28
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