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youngsun50木虫 (正式写手)
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细菌膜蛋白提取后复溶？
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各位虫友，我提取的是G-细菌膜蛋白，用的是超速离心的方法，具体如下： 1. 100ml过夜培养菌液，离心洗涤，后2ml生理盐水重悬； 2. 超声破碎后，5000g,20min去除未破壁细胞； 3. 100,000g,4度离心1h； 4. 沉淀用3ml含2%SLS的生理盐水重悬，室温放置30min后用枪头轻轻吹打使之溶解；100,000g,4度离心1h； 5. 重复步骤4一次； 6. 用200ul蒸馏水溶解沉淀。 结果加入蒸馏水后沉淀不能溶液，过夜也不行，加入了2%SDS后，50度复溶也不行。试了2%triton-100也不行。 请问，有遇到这种情况的吗，怎么解决啊？ 谢谢了  |
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youngsun50
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我的操作过程： 100ml过夜培养的细菌，经离心收集，并用Tris-Mg 缓冲液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM MgCl2]洗涤，后重悬于3ml Tris-Mg 缓冲液中。冰浴超声破碎菌体，6000g，10min离心收集上清液，弃去未破碎细菌，上清液4 ℃ 100,000g 离心lh，收集沉淀。用5ml含2％的十二烷基肌氨酸钠（SLS）的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min，100,000g 室温离心lh，收集沉淀，重复该步骤一次，最后得到的沉淀（即为外膜蛋白）用100~200ul TES缓冲液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM乙二胺四乙酸（EDTA）, 2%十二烷基磺酸钠（SDS）]溶解。 TES溶解蛋白效果好一些，但冻存复溶时还是有沉淀，但我觉得对定性没影响。对于你的冷冻菌体提取，我一般也收集完菌体，冻与-20或-70，第二天再进行下一步，没啥影响。不知冻的时间长了对外膜蛋白分离有啥影响？ |
3楼2013-05-03 16:40:38
youngsun50
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5楼2013-05-04 11:58:16