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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 细菌膜蛋白提取后复溶？
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youngsun50

木虫 (正式写手)

[求助] 细菌膜蛋白提取后复溶？

各位虫友，我提取的是G-细菌膜蛋白，用的是超速离心的方法，具体如下：
1.        100ml过夜培养菌液，离心洗涤，后2ml生理盐水重悬；
2.        超声破碎后，5000g,20min去除未破壁细胞；
3.        100,000g,4度离心1h；
4.        沉淀用3ml含2%SLS的生理盐水重悬，室温放置30min后用枪头轻轻吹打使之溶解；100,000g,4度离心1h；
5.        重复步骤4一次；
6.        用200ul蒸馏水溶解沉淀。
结果加入蒸馏水后沉淀不能溶液，过夜也不行，加入了2%SDS后，50度复溶也不行。试了2%triton-100也不行。
请问，有遇到这种情况的吗，怎么解决啊？

谢谢了
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学会感恩，强大自我
1楼 2012-12-11 10:18:16
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May的旅行箱

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
zhangxingc: 金币+4, 鼓励新虫发帖，欢迎常到微生物版 2013-05-02 14:23:33
您好！您的问题现在解决了吗？
我目前也是在做G-的膜蛋白提取，也用的是超离的方法，加的SLS也是2%的孵育半小时，提取过后跑电泳，提取材料用的是-20℃的菌体时一直跑不出电泳条带，用新鲜菌液做的时候就有条带过，很费解啊…………由于现实原因我的实验材料只有-20℃冷冻保藏的菌体，无法新鲜培养，一直没有进展，求大师指点啊！
对了，我是用的tris-HCl（pH=7.5）溶解的蛋白。
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2楼2013-05-02 09:07:52
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by May的旅行箱 at 2013-05-02 09:07:52
您好！您的问题现在解决了吗？
我目前也是在做G-的膜蛋白提取，也用的是超离的方法，加的SLS也是2%的孵育半小时，提取过后跑电泳，提取材料用的是-20℃的菌体时一直跑不出电泳条带，用新鲜菌液做的时候就有条带过， ...

我的操作过程：
100ml过夜培养的细菌，经离心收集，并用Tris-Mg 缓冲液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM MgCl2]洗涤，后重悬于3ml Tris-Mg 缓冲液中。冰浴超声破碎菌体，6000g，10min离心收集上清液，弃去未破碎细菌，上清液4 ℃ 100,000g 离心lh，收集沉淀。用5ml含2％的十二烷基肌氨酸钠（SLS）的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min，100,000g 室温离心lh，收集沉淀，重复该步骤一次，最后得到的沉淀（即为外膜蛋白）用100~200ul TES缓冲液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM乙二胺四乙酸（EDTA）, 2%十二烷基磺酸钠（SDS）]溶解。  
TES溶解蛋白效果好一些，但冻存复溶时还是有沉淀，但我觉得对定性没影响。对于你的冷冻菌体提取，我一般也收集完菌体，冻与-20或-70，第二天再进行下一步，没啥影响。不知冻的时间长了对外膜蛋白分离有啥影响？
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学会感恩，强大自我
3楼2013-05-03 16:40:38
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May的旅行箱

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by youngsun50 at 2013-05-03 16:40:38
我的操作过程：
100ml过夜培养的细菌，经离心收集，并用Tris-Mg 缓冲液洗涤，后重悬于3ml Tris-Mg 缓冲液中。冰浴超声破碎菌体，6000g，10min离心收集上清液，弃去未破碎细菌，上清液4 ℃ 100,000g 离心lh，收集沉 ...

非常感谢啊！我试试看TES缓冲液溶解看,不过SDS不是变性剂么？加这个会使膜蛋白的溶解性增加么？为什么不是加2%的SLS？
我的菌体是从工厂那边拿过来的，放了有好几个月了，另外，你的电泳跑的效果怎么样呢？在上样前是怎么处理蛋白的？我用的是加入2*buffer后70℃温育10min后上样
我又有看到说是在制胶的时候加入4M的尿素会增加膜蛋白的溶解性，这个你有试过的么?
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4楼2013-05-04 11:20:57
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youngsun50

木虫 (正式写手)
SDS使蛋白变性应该没事儿，你最后电泳时也一般用的变性电泳啊。SLS不行，它选择性溶解膜其他组分，最后OMP不是沉淀收集了吗? 我的效果还挺好，上样就加等体积2*buffer，100度5-10min。尿素我没特意加过

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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学会感恩，强大自我
5楼2013-05-04 11:58:16
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