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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助怎样使细菌细胞裂解但胞内的蛋白（例如酶）不失活？
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gg880712

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助怎样使细菌细胞裂解但胞内的蛋白（例如酶）不失活？

如题：怎样使细菌细胞裂解但胞内的蛋白（例如酶）不失活？除了用超声波还有没有其他方法？
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1楼 2012-11-19 13:35:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用无去垢剂缓冲液重悬，冰水浴超声破碎，离心取上清。
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2楼2012-11-19 14:04:05
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该可以用离心的方法吧，破坏细胞结构
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may
3楼2012-11-19 15:01:24
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gg880712: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-19 18:08:39
小丹木木: 金币+2, 欢迎应助 2012-11-20 17:25:03
这主要是涉及大破碎方法的问题：
常用的有  1. 超声波破碎，需要控制低温、工作/间隔时间、功率等；
              2. 溶菌酶+DNase，这个是温和的做法，应该适合楼主使用，protocol网上有很多；
              3. 高压破碎等。
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小兵一个
4楼2012-11-19 15:34:48
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gg880712

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by linxt2005 at 2012-11-19 15:34:48
这主要是涉及大破碎方法的问题：
常用的有  1. 超声波破碎，需要控制低温、工作/间隔时间、功率等；
              2. 溶菌酶+DNase，这个是温和的做法，应该适合楼主使用，protocol网上有很多；
               ...

我尝试过超声破碎，放在冰浴中，5秒破碎，5秒间隔，破碎了10分钟，但是离心后取上清做实验发现没有活性。我决定尝试一下溶菌酶。谢谢你呀
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5楼2012-11-19 18:08:30
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匿名

用户注销 (著名写手)
本帖仅楼主可见
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6楼2012-11-19 21:27:00
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gg880712

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 彬心玉壶 at 2012-11-19 21:27:00
我用的是   高压破碎（French press） 然后离心去掉碎片。可以根据蛋白质的特性（可溶，或者不可溶，） 超速离心，进一步去掉一些杂蛋白。

具体怎么做呢？可不可以详细说一下？
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7楼2012-11-20 11:09:02
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
★ ★
小丹木木: 金币+2, 欢迎交流 2012-11-20 17:25:17
引用回帖:
5楼: Originally posted by gg880712 at 2012-11-19 18:08:30
我尝试过超声破碎，放在冰浴中，5秒破碎，5秒间隔，破碎了10分钟，但是离心后取上清做实验发现没有活性。我决定尝试一下溶菌酶。谢谢你呀...

超声波破碎后上清没有酶活可能是你超声波条件的问题
1：破碎细胞没破开，功率太低，时间太短都可能造成细胞没碎开，没碎开哪来酶活，你破碎后澄清一些没，相比破碎之前？
2：蛋白失活，不太清楚你是破的野生菌还是重组菌，可能的原因是功率太大超声波时间太长发热造成破碎后的蛋白变性了，这个你可以观察到超声波后有很多的片状沉淀，那就是变性的蛋白，重组菌的话还要考虑包涵体的问题.
PS：  GL.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
8楼2012-11-20 17:00:16
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gg880712

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Marado at 2012-11-20 17:00:16
超声波破碎后上清没有酶活可能是你超声波条件的问题
1：破碎细胞没破开，功率太低，时间太短都可能造成细胞没碎开，没碎开哪来酶活，你破碎后澄清一些没，相比破碎之前？
2：蛋白失活，不太清楚你是破的野生菌还 ...

我破碎后是澄清了些的。。至于蛋白有没有变性，没仔细看。再试一把好了。我破的是野生型菌和突变体（敲除了一个基因的），应该不存在你说的包涵体的问题。
p.s.谢谢啦
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9楼2012-11-20 17:29:25
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)
有很多公司卖细菌裂解液的，比如QIAGEN，比较温和，
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星陈代谢
10楼2012-11-20 20:24:10
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