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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » real time PCR NTC 阳性扩增
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axiye

新虫 (小有名气)

[求助] real time PCR NTC 阳性扩增

最近在做real time PCR实验，突然有一次发现用模板10倍稀释所做的标准曲线完全不标准，后来发现无模板对照也有阳性扩增，拿回来跑胶发现是目的片段，切胶回收测序也没有问题，有没有兄弟姐妹遇到过这种问题啊，都是怎么解决的呢？做了快一个月了，仍找不到具体原因，希望高手能够解答！
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1楼 2012-10-30 14:25:32
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caoxin1984

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意楼上的观点。
此外，“标准曲线完全不标准”注意引物的问题。有些引物设计不合理，或者引物的条件（如退火温度、引物浓度等）不合适，那么标准曲线就不好。
还有，模板中目的基因的含量有多高，如果模板中含量不高，那么就不建议稀释。Ct值15-25之间比较理想
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3楼2012-10-30 20:13:08
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 热心的虫虫，欢迎常来 2012-10-30 16:04:48
axiye: 金币+10, ★有帮助 2013-02-25 13:42:19
1、楼主的问题其实挺笼统的，N有条带，还是目的片段，说明模板混入了哈，气溶胶？用的枪吸入污染？都有可能
2、稀释10倍跑的不准，注意稀释液和稀释倍数的准确性
3、跑一下内参，看看是技术操作问题，还是PCR体系问题。
4、除了问题，重复两次后仍然有同样的问题，就先停止试验，好好去查查文献。注意，Qpcr的移液器我们都是单独使用的！包括加内参的、N的都是单独用！一般是先配出N来！
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2楼2012-10-30 15:29:49
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
气溶胶污染或是引物。水的污染，一个个排除..
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jiayoubashaonian
4楼2012-10-30 20:16:55
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axiye

新虫 (小有名气)
我用了实验室其他人的引物，同样的条件，也是可以P出来，是不是因为循环数（40个）太多导致？但是realtime PCR不都是需要40个循环的吗？

我尝试过在超净台做过，所有的试剂都是新的，枪头、PCR管等用到的都是灭菌或杀过菌的，一样能P得出来，在外边和里边做没区别，我直觉不是污染的问题。

论坛中About PCR那个贴子我也看过，也有这样的问题，楼主说最后改变了退火温度就好了，我还尝试了60-70的温度梯度PCR，发现接近70度时，目的条带才慢慢变少了，但还是有，是不是引物的问题啊，需要重新设计会不会好些？
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5楼2012-10-30 21:24:49
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