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beescity

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 引物设计跨内含子,操作中如何快速实现?

经常都在说检测mRNA,引物设计要跨内含子,道理也知道。
大家平时在实际操作时候,是如何实现的啊?
难道设计出来了之后手动去某段引物是不是在一个外显子的边缘,另一个又是在相邻外显子?这个方法是不是太慢了?
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竹子小小

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这。。我做水稻直接就拿NCBI上目标基因的mRNA来设计就可以了。
2楼2012-10-29 15:18:34
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
NCBI有相应的工具,一般跨内含子时3`端有少数在里面的外显子.
为什么
3楼2012-10-29 22:43:32
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beescity

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 547star at 2012-10-29 22:43:32
NCBI有相应的工具,一般跨内含子时3`端有少数在里面的外显子.

目的序列不是在NCBI的怎么办呢?粘进去?这样又不知道内含子和外显子啊。
4楼2012-10-30 08:07:21
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-30 15:55:26
引用回帖:
4楼: Originally posted by beescity at 2012-10-30 08:07:21
目的序列不是在NCBI的怎么办呢?粘进去?这样又不知道内含子和外显子啊。...

一种是查找相似序列,以相似序列来预设计,一种是用软件设计,比如primer5可以在某一区移动找出相对得分高的作为引物.另外,有时候,只要一条引物是跨内含子,就可以区分从基因组DNA扩增和从mRNA扩增.现在也有通过DNase降解处理来解决无法找到好的跨内含子引物的问题。
为什么
5楼2012-10-30 09:48:35
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beescity

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2012-10-30 09:48:35
一种是查找相似序列,以相似序列来预设计,一种是用软件设计,比如primer5可以在某一区移动找出相对得分高的作为引物.另外,有时候,只要一条引物是跨内含子,就可以区分从基因组DNA扩增和从mRNA扩增.现在也有通过DNase降 ...

可不可以这样理解。如果做了DNase处理的mRNA样品,不一定要求引物要垮内含子。
用保守序列来找引物,只能手动排查了?天啊,我好怕这个过程,眼神容易看走眼。
6楼2012-10-30 10:41:01
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
NCBI有个primer的设计软件,其中有个选项就是跨内含子设计引物。。。呵呵,自己找下,很简单的。。。
7楼2012-10-30 21:54:30
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beescity

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-10-30 21:54:30
NCBI有个primer的设计软件,其中有个选项就是跨内含子设计引物。。。呵呵,自己找下,很简单的。。。

我把别的网站的基因组序列粘贴进去,能看到内含子么?
8楼2012-10-31 00:00:58
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:08:33
引用回帖:
6楼: Originally posted by beescity at 2012-10-30 10:41:01
可不可以这样理解。如果做了DNase处理的mRNA样品,不一定要求引物要垮内含子。
用保守序列来找引物,只能手动排查了?天啊,我好怕这个过程,眼神容易看走眼。...

有mDNA和genome DNA序列,找出mRNA中外显子拼接的地方,没有太多可以挑选的.至于DNase处理的mRNA样品...如果是做定量PCR,就我看到生工之类引物合成公司帮设计的,就没考虑跨内含子的.当然,如果你也用这样的方法,个人建议要做对照,具体多看点文献吧.
为什么
9楼2012-10-31 08:30:29
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beescity

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 547star at 2012-10-31 08:30:29
有mDNA和genome DNA序列,找出mRNA中外显子拼接的地方,没有太多可以挑选的.至于DNase处理的mRNA样品...如果是做定量PCR,就我看到生工之类引物合成公司帮设计的,就没考虑跨内含子的.当然,如果你也用这样的方法,个人建 ...

老兄,找出拼接地方之后怎么操作?把这部分序列粘出来?然后设计。还是用整个cDNA序列设计之后看哪些引物落在这个区域。有图解么?人太低端了,理解不了。
10楼2012-11-02 09:12:20
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