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定点突变PCR的有关问题
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刚开始做定点突变这个实验，遇到很多的问题，还请有经验的童鞋们多多帮忙，不胜感激！ 用DpnI酶切时间需要一个小时那么久吗？我看的说明书上说只需要5分钟，试剂盒是买的Quick change的！但是，按照说明书上做下来并没有长出菌落，想问一下做过的童鞋，你们一般做转化时用的感受态一般是多少啊，这个说明书上说45μl，总感觉少了点！而且热激的时间是30s，以往我做的一些克隆实验都是用的90s啊？在做复苏菌体时要求用NZYM培养基，我这没有现成的，就用了LB代替啊？结果基本上都看不到菌落！还想问一下，转化之前先加入巯基乙醇的作用是什么啊？有必要这样做吗？ 问题很多，还望用经验的童鞋能帮忙解答一下！！谢谢谢谢谢！ |
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送鲜花一朵 
谢谢谢谢，感谢指导！第一次做，问题很多！ 
3楼2012-10-14 22:10:07
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-15 13:40:32
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| 有些限制性内切酶是time saver qualified enzyme，1ul酶可以在5分钟消化1ugDNA，比如你说的DpnI。虽然如此，我个人还是建议做1-2小时。转化一般使用50-100ul的感受态细胞。热激的最佳时间根据不同感受态细胞不一样。如果你买的是盒子，公司都做了不同热激时间的转化效率，说明30s已经可以达到很好的效果，用protocol上面说的没问题。如果你实在不放心，可以多加10s。你说的90S是针对按传统方法自制的感受态细胞，效率没有公司做的高。复苏菌是用rich培养液是为了给菌一个更好的环境，用LB代替是没问题的。加巯基乙醇是为了增加转化效率，做不做没有太大关系。 |
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