| 查看: 558 | 回复: 3 | |||
[求助]
定点突变PCR的有关问题
|
|
刚开始做定点突变这个实验，遇到很多的问题，还请有经验的童鞋们多多帮忙，不胜感激！ 用DpnI酶切时间需要一个小时那么久吗？我看的说明书上说只需要5分钟，试剂盒是买的Quick change的！但是，按照说明书上做下来并没有长出菌落，想问一下做过的童鞋，你们一般做转化时用的感受态一般是多少啊，这个说明书上说45μl，总感觉少了点！而且热激的时间是30s，以往我做的一些克隆实验都是用的90s啊？在做复苏菌体时要求用NZYM培养基，我这没有现成的，就用了LB代替啊？结果基本上都看不到菌落！还想问一下，转化之前先加入巯基乙醇的作用是什么啊？有必要这样做吗？ 问题很多，还望用经验的童鞋能帮忙解答一下！！谢谢谢谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有211人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 定点突变位置的确定
已经有6人回复
- 点突变引物设计的问题
已经有11人回复
- 点突变感受态细胞
已经有6人回复
- 关于定点突变的问题
已经有6人回复
- 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？
已经有16人回复
- 定点突变出酶切之后出问题求助！！！急 求高手
已经有9人回复
- 【求助/交流】定点突变方法突变位点的确定
已经有8人回复
- 【求助/交流】定点突变试剂盒
已经有13人回复
- 【求助/交流】定点突变酶切之后出问题，请教高手~~~~！！！
已经有13人回复
- 【求助/交流】关于PCR产物的突变
已经有7人回复
- 【求助/交流】定点突变-DpnI消化
已经有12人回复
- 【求助/交流】点突变
已经有13人回复
- 【求助/交流】定点突变PCR后加DPN1酶的作用
已经有4人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-15 13:40:32
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-15 13:40:32
| 有些限制性内切酶是time saver qualified enzyme，1ul酶可以在5分钟消化1ugDNA，比如你说的DpnI。虽然如此，我个人还是建议做1-2小时。转化一般使用50-100ul的感受态细胞。热激的最佳时间根据不同感受态细胞不一样。如果你买的是盒子，公司都做了不同热激时间的转化效率，说明30s已经可以达到很好的效果，用protocol上面说的没问题。如果你实在不放心，可以多加10s。你说的90S是针对按传统方法自制的感受态细胞，效率没有公司做的高。复苏菌是用rich培养液是为了给菌一个更好的环境，用LB代替是没问题的。加巯基乙醇是为了增加转化效率，做不做没有太大关系。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
yiyijiayou212楼2012-10-13 08:32:56
谢谢谢谢，感谢指导！第一次做，问题很多！ 3楼2012-10-14 22:10:07
4楼2015-12-07 10:52:50