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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr产物无法完全测序
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stella108

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr产物无法完全测序

我的片段大约800bp，pcr扩增的条带很亮，但是测序时只能测出来400bp，后面开始信号弱，高人们帮我分析一下是什么原因，应该怎么办？
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1楼 2012-09-23 20:26:20
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beishui

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以连接到载体上，从新转化挑取单克隆，提质粒，酶切检测一下，拿载体去测序
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宠辱不惊，看庭前花开花落；去留无意，望天上云卷云舒。
2楼2012-09-23 20:53:23
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你让他双向测通看一下！
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-09-23 20:55:02
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stella108

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-23 20:55:02
你让他双向测通看一下！

测了，但反向为简并引物，测得效果也不好
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4楼2012-09-25 13:08:55
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zqt123_1981

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by stella108 at 2012-09-25 13:08:55
测了，但反向为简并引物，测得效果也不好...

我也是耶，700bp左右，第一次说我的纯化产物量太低测不出来，第二次浓度很高，电泳显示一条带，结果说是有咋信号。可能是里边不止一条带。没办法现在在单克隆！！！！！
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5楼2012-09-25 13:49:13
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-09-25 19:03:29
1：不纯
2：浓度低
3：何不连到T载体上去测，要不了多少时间，结果还准确.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-09-25 14:58:28
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gumling2003

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以考虑做AT克隆，再进行双向测序！
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7楼2012-09-25 15:47:31
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你问测序公司能不能帮你进行walking，试一下
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8楼2012-09-26 15:34:17
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david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-27 14:05:28
首先我觉得如果做到质粒里面测序可能会好一些，毕竟通用引物的效率会高一点，另外可能也有测序公司的问题啊，有些公司确实测到400之后就不能相信了，可以考虑换家公司...
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哈哈
9楼2012-09-27 13:55:47
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

用PCR产物直接测序经常出现这种情况。TA克隆，双向测序可以解决。
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10楼2012-09-27 15:09:47
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