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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 250bp，可以直接测序，不转载体吗？
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)

[求助] 250bp，可以直接测序，不转载体吗？

250bp，可以直接测序，不转载体吗？
可以用双向测序，就可以得到全部确切的序列，这样理解对吗？
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1楼 2011-06-19 20:28:39
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gumingzhu

金虫 (正式写手)
貌似不可以吧
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改掉一个旧习惯有多难？？？？
2楼2011-06-19 20:45:49
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gumingzhu at 2011-06-19 20:45:49:
貌似不可以吧

为什么不可以呢？
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3楼2011-06-19 21:06:34
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gumingzhu at 2011-06-19 20:45:49:
貌似不可以吧

谢谢解答
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4楼2011-06-19 21:06:48
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gumingzhu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不连在载体上你怎么扩增呢，就pcr出来的那点东西根本不够测序需要的浓度，要把片段连在载体上，一般转化入大肠进行扩增，再送菌液或者提质粒送测序
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改掉一个旧习惯有多难？？？？
5楼2011-06-19 21:11:35
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tongxinkxy

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gumingzhu at 2011-06-19 21:11:35:
不连在载体上你怎么扩增呢，就pcr出来的那点东西根本不够测序需要的浓度，要把片段连在载体上，一般转化入大肠进行扩增，再送菌液或者提质粒送测序

我以前测序的时候，都是直接测的，最近有朋友要测200多的，我以前都是测1000bp的，所以不知道200bp可不可以测
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6楼2011-06-19 21:14:42
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
tongxinkxy(金币+8): 2011-06-20 08:16:38
lstt09nk(金币+3): 感谢交流 2011-06-20 13:07:01
1   pcr产物测序，需要非简并引物

2  如果特异引物扩增，条带浓度达到回收要求，可以pcr产物测序。

3  根本不需要双向，一个反应足够了。

4  鉴于pcr产物测序会损失部分序列，结果肯定没有200bp了。 即便双向测序，也无法得到准确全部序列。

5  200bp的产物，做载体连接成功率非常高，推荐如果不是特别着急，还是转了吧。

解答完毕。
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7楼2011-06-19 21:27:10
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yitiandeng

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

tongxinkxy(金币+8): 2011-06-20 08:16:41
不可以，这事因为即使测序效果好的话，也不行，应为测序峰图前分别剪切掉几十个核苷酸后你看看你的序列就好友100多了所以300BP以下的不建议做PCR直接测序
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8楼2011-06-19 23:27:34
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silicare

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优秀版主
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励 2011-06-20 13:07:33
完全可以，放心去测吧，

一定要双向，否则引物后的20bp还有末端几个bp都测不出
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9楼2011-06-20 08:21:26
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段家一凡

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2011-06-19 21:27:10:
1   pcr产物测序，需要非简并引物

2  如果特异引物扩增，条带浓度达到回收要求，可以pcr产物测序。

3  根本不需要双向，一个反应足够了。

4  鉴于pcr产物测序会损失部分序列，结果肯定没有200bp了。 即便 ...

两点错误，当然需要双向测序，一个方向测就会导致引物后几十个碱基不确定，双向测就可以根据另一端测过来的序列补上。实际上PCR产物测序是最准确的，连到载体测很有可能出错。
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10楼2011-06-20 16:39:03
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