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bydw1989

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教蛋白双向电泳与质谱方面的一些问题

1.请问能直接从双向电泳图上分辨出结构蛋白与功能蛋白吗？

2.上图是我蛋白点的质谱分析结果，如何从中挑选有意义的点做二级质谱？挑峰度高的吗？

3.做二级质谱的话可以确定肽的序列吗？看到过一个帖子说通过二级质谱，根据碎片的b和y系列离子可以推出序列，请问大家有相关文章吗？

请各位大神多多指教。

       我是我们实验室第一个做蛋白的，根本没基础，看了些文章，感觉还是步履蹒跚，可以给些蛋白质谱分析的文献资料什么的吗，先谢谢大家啦！！

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1楼2012-09-12 21:47:08
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励应助 2012-09-13 14:34:20
1.电泳只是起到蛋白分子量鉴定的作用，而且双向电泳更多是来确定目的蛋白的。不能通过电泳分辨出结构蛋白与功能蛋白。
2.如果你是用Q-tof的，建议你每一个都做一下二级谱图，毕竟你不知道一级谱得到的是蛋白碎片还是杂蛋白。
3.二级谱理论上是不能直接做未知蛋白序列的分析的。未知序列更多是要依赖酶切或者化学方法水解，并且只能测得N端或者C端的十几个氨基酸。
但是可以分析已知序列上的修饰，比如二硫键什么的。当然碰撞池的碰撞概率不同，有时候可能得不到你需要的碎片。
至于文章，可以去google上找，很多的，看别人是怎么做的，但是我觉得更多还是要靠自己去摸索的。
希望能帮上。
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2楼2012-09-13 10:59:52
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bydw1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-13 10:59:52
1.电泳只是起到蛋白分子量鉴定的作用，而且双向电泳更多是来确定目的蛋白的。不能通过电泳分辨出结构蛋白与功能蛋白。
2.如果你是用Q-tof的，建议你每一个都做一下二级谱图，毕竟你不知道一级谱得到的是蛋白碎片还 ...

我用的MALDI-TOF，需要每个都做二级质谱吗？还是通过两个差异蛋白对比选峰度差别最大的呢？求指点，谢谢啦~~
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3楼2012-09-13 11:54:09
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by bydw1989 at 2012-09-13 11:54:09
我用的MALDI-TOF，需要每个都做二级质谱吗？还是通过两个差异蛋白对比选峰度差别最大的呢？求指点，谢谢啦~~...

如果只是单一的一种蛋白，那么一般一级质谱分析后选取强度较大的峰进行二级质谱分析。
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4楼2012-09-13 12:43:20
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bydw1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-13 12:43:20
如果只是单一的一种蛋白，那么一般一级质谱分析后选取强度较大的峰进行二级质谱分析。...

我有个疑问，像目的基因，我们可以通过片段的拼接来得到这个目的基因。那我把蛋白通过质谱打碎后得到的是小的片段，通过数据库搜索得到的不也是这一个个小的多肽的信息吗，并不是之前的大片段啊。求指点，谢谢~~~
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5楼2012-09-13 19:47:49
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
bydw1989: 金币+10, ★有帮助 2012-09-14 21:26:59
引用回帖:
5楼: Originally posted by bydw1989 at 2012-09-13 19:47:49
我有个疑问，像目的基因，我们可以通过片段的拼接来得到这个目的基因。那我把蛋白通过质谱打碎后得到的是小的片段，通过数据库搜索得到的不也是这一个个小的多肽的信息吗，并不是之前的大片段啊。求指点，谢谢~~~...

首先你得有数据库。
再者就算分子量是一样你也不能确定就是某种氨基酸，亮氨酸和异亮氨酸分子量就是一样的（应该没记错），做二级谱的目的就是进一步将裂解的大片段继续裂解。
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6楼2012-09-13 23:07:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
做二级质谱的话可以确定肽的序列吗？看到过一个帖子说通过二级质谱，根据碎片的b和y系列离子可以推出序列，请问大家有相关文章吗？

请各位大神多多指教。

用MS-MS对多肽测序的问题，我回答过，请见：
确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计：凌波丽个人总结之二
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957

但是MS-MS只能从头测定出大约40个氨基酸以下的多肽的序列，再多的话就无能为力了，而且需要相关的软件。
要具体了解可见：魏开华、应天翼 等 编著，蛋白质组学实验技术精编，化工出版社，2010,101-103.
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7楼2014-08-21 12:03:03
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
用MS-MS对多肽的从头测序 不是 用MS测定蛋白质的酶解片段从数据库中鉴定出已知的蛋白质！两者是不同的过程！请见：魏开华、应天翼 等 编著，蛋白质组学实验技术精编，化工出版社，2010,101-105，里面对两种质谱操作说的很清楚，另外还有不少英文版的MS指导书具体说明了用MS-MS对多肽的从头测序 和 用MS测定蛋白质的酶解片段从数据库中鉴定出已知的蛋白质这两种截然不同的操作。
另外也可以用Ladder Sequencing 方法（阶梯法）对蛋白质进行从头测序，这就是将MS与Edman降解法两者结合，Edman降解从N末端每次降解下来一个氨基酸，形成PTH-AA，然后此PTH-AA不用HPLC通过分子量鉴定，而是通过MS鉴定出其分子量，进而通过MS获得Edman降解从N末端每次降解下来一个氨基酸的身份，周而复始获得此蛋白质的全序列。
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8楼2014-08-21 12:11:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
1.请问能直接从双向电泳图上分辨出结构蛋白与功能蛋白吗？
答：从序列即可预测除蛋白质的功能，参见：
D. J. Rigden Edits, From Protein Structure to Function with Bioinformatics(2009)       
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6382178
当然有不少误差。
但是我不懂蛋白质何以分为结构蛋白与功能蛋白？哪种蛋白质没有功能？

2.上图是我蛋白点的质谱分析结果，如何从中挑选有意义的点做二级质谱？挑峰度高的吗？
答：质谱分析要对比不同条件下的质谱峰，尤其是峰高和峰位置在不同条件下改变的那些峰。有许多有价值的质谱峰本身不高，比如用MADLI-MS检测蛋白质-蛋白质相互作用的时候，出现的蛋白质-蛋白质相互作用的特异性质谱峰就不高。蛋白点的质谱分析结果，如何从中挑选有意义的点做二级质谱，要看你具体的操作目地了，峰高与峰对应的肽片段或氨基酸正离子的丰度有关，但是那种肽片段或氨基酸正离子不是你需要的也没用，甚至可能就不是的肽片段或氨基酸正离子的质谱峰也有可能，与你的样品制备也有关系。
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9楼2014-08-21 12:21:32
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