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zoeye

金虫 (小有名气)


[资源] PCR反应体系中各种成分的作用-搜集版

最近PCR总是P不出来
于是看了些版的讨论
以下为搜集的讨论资料 对PCR条件优化进行了比较详细的分析
希望对大家有帮助
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不同模板浓度的实验结果 
用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行PCR扩增,发现在模板量<25ng的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ng左右时无扩增产物;当模板量在25ng~200ng之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ng时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μl的PCR反应体系中,模板DNA以25~100ng为最适用量。同时模板DNA在200ng以下不影响扩增结果,但为降低TE缓冲液中EDTA对反应体系中Mg2+的不良影响程度,应该尽量降低DNA模板用量。
       不同Mg2+浓度时实验结果 
设置不同Mg2+浓度,当Mg2+浓度为1 0mM时,无PCR扩增产物;Mg2+浓度为1 5~2 5mM时,随着Mg2+浓度的增加,PCR扩增产物带型基本一致,但以2 0mM的扩增效果最好
    不同引物浓度对PCR结果的影响 
设置5种不同浓度的引物进行PCR扩增,当引物浓度在0 1~0 2μM时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μM左右为宜。
       不同dNTP浓度对PCR结果的影响 
采用2种引物(OPB17、OPA16),分别以4种不同的dNTP浓度进行PCR反应,发现dNTP浓度在100μM、150μM、200μM、300μM时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当dNTP浓度<200μM时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与dNTP浓度呈正相关。综合考虑,以100~200μM的dNTP浓度为佳。
       TaqDNA聚合酶对扩增结果的影响 
设置5个梯度的TaqDNA聚合酶浓度,结果表明随着TaqDNA聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5u~2 5u浓度间均有扩增产物,但随着TaqDNA聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,TaqDNA聚合酶浓度以1 0~1 5u结果较好
       不同退火温度下的扩增效果 
引物用OPD16和OPA01,按照优化的PCR反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。

      Mgcl2与dNTP互相作用及对PCR反应的影响 用同一引物OPD07、相同模板DNA比较3种Mg Cl2浓度与3种dNTP浓度完全随机相结合的9个处理的PCR结果,研究了Mgcl2与dNTP的相互作用。结果表明,Mgcl2在低浓度时,过量的dNTP对Mg2+的螯合作用明显,表现为降低Mg2+的酶催作用,PCR扩增产物减少或无,而低量的dNTP对Mg2+酶催的抑制作用减少,PCR扩增产物增多。在高浓度Mgcl2浓度下,dNTP无抑制作用。在相同Mg2+离子浓度和足量dNTP时,扩增产物相似。1-9泳道分别代表Mgcl2(mM)/dNTP(μM)的浓度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、3/300)。
以下略....
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  • 2012-09-12 10:07:17, 258.81 K

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cpu随心

新虫 (小有名气)


★★★ 三星级,支持鼓励

谢谢
240楼2013-02-26 00:15:37
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