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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胶回收老收不到，请教高手
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sjjsy7

银虫 (小有名气)

[求助] 胶回收老收不到，请教高手

本人新手，最近在构载体，刚把基因都P出来，可酶切后老是收不到片段，各种方式都试过了还不行，现想问一下做过的前辈，做胶回收要注意些什么？还有就是哪个公司的试剂盒回收效率高点，我用的是天跟的，不过都放2年多了，马上要中期考核了，很着急，请各位高手帮忙！！！
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1楼 2012-09-01 22:37:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone: 回帖置顶 2012-09-17 17:19:48
1949stone: MolEPI+1, very good 2012-09-17 17:20:12
个人见解，胶回收重要点：

电泳要让目的条带与杂带分开，以防污染；电泳液最好换新的。切胶要完全。
溶胶58度，10分钟，期间混匀3次，保证充分融化。

冰浴约5分钟（此步非常重要，一般试剂盒中都说是冷却至室温，但是温度越低与柱子结合效率越高。不管是质粒提取试剂盒还是胶回收，包括后面的洗脱EB预热是一个道理，温度高柱子结合效率低，温度低结合效率高。所以试剂盒的保存条件是不高于35度，高温保质期短）

冰浴后上柱离心按步骤来。空甩后注意让乙醇挥发完全，直接用鼻子闻下即可，看是否有乙醇味道。
加洗脱液EB，60度放置2-3分钟后高速离心1次即可。
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20楼2012-09-17 16:27:40
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windleakey

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sjjsy7: 金币+1 2012-09-02 16:43:43
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-09-17 17:22:30
我也是新手，最近才做了两次胶回收，用的omega的，也是放在那很久了的，我是用来做转化的所以浓度得高点，我发现最后用无菌三蒸水洗脱时，把洗脱下来的液体再吸回到吸附柱里，再重复洗脱一次，浓度就比以前大不少，希望对你有帮助
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2楼2012-09-01 23:16:58
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nictkk

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by sjjsy7 at 2012-09-24 22:29:39
。。。。。你谁WHO?报上大名！！！...

根据你提出的问题我就猜到应该是你了。。我是你师兄。。
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24楼2012-09-25 15:20:55
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普通回帖

mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sjjsy7: 金币+1 2012-09-02 16:43:50
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-09-17 17:23:15
限制酶有没有被污染了？跑完胶有没有看到正确的DNA带？回收试剂可以放很久的，应该没有问题。检查一下胶融化后的pH值，回收液应该是黄色的。
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3楼2012-09-02 04:09:23
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qiaoxianying

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看一下溶胶液的PH值，把它调到原来的数值
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4楼2012-09-02 08:47:54
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xiaxuel

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-09-02 17:07:49
胶回收应该注意，跑胶的Buffer 为新的，也可能是试剂盒保质期到了，建议换新的试剂盒！我用的是一款国产的试剂盒--karroten 效果很好！回收效率也很高，希望对你有所帮助！
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5楼2012-09-02 15:14:25
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 好久不见啊 我最近来的少啊 2012-09-17 17:23:54
我用的Axygen的，感觉效果不错。你的盒子放了这么久，质量真没保证，重新买一个吧，又不太贵。还有就是短片段（<400bp）回收可能效率也低一些，可以加异丙醇。
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6楼2012-09-02 16:19:12
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by windleakey at 2012-09-01 23:16:58
我也是新手，最近才做了两次胶回收，用的omega的，也是放在那很久了的，我是用来做转化的所以浓度得高点，我发现最后用无菌三蒸水洗脱时，把洗脱下来的液体再吸回到吸附柱里，再重复洗脱一次，浓度就比以前大不少， ...

谢谢，我试试！
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7楼2012-09-02 16:36:33
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mitocam at 2012-09-02 04:09:23
限制酶有没有被污染了？跑完胶有没有看到正确的DNA带？回收试剂可以放很久的，应该没有问题。检查一下胶融化后的pH值，回收液应该是黄色的。

有我要的带，我测了胶溶后的PH值，是正常的！
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8楼2012-09-02 16:38:44
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by qiaoxianying at 2012-09-02 08:47:54
看一下溶胶液的PH值，把它调到原来的数值

那原来的PH值大概是多少？我现在也觉得溶胶液可能有点问题！
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9楼2012-09-02 16:40:27
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaxuel at 2012-09-02 15:14:25
胶回收应该注意，跑胶的Buffer 为新的，也可能是试剂盒保质期到了，建议换新的试剂盒！我用的是一款国产的试剂盒--karroten 效果很好！回收效率也很高，希望对你有所帮助！

谢谢！我还特意换了新的BUFFER，可能就是试剂盒有问题了！
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10楼2012-09-02 16:42:03
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