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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胶回收老收不到，请教高手
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by joan198108 at 2012-09-02 16:19:12
我用的Axygen的，感觉效果不错。你的盒子放了这么久，质量真没保证，重新买一个吧，又不太贵。还有就是短片段（<400bp）回收可能效率也低一些，可以加异丙醇。

谢谢了，我的片段大于400，有1000多，我也考虑新买盒子！
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11楼2012-09-02 16:43:25
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xu523130761

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
1949stone: 金币+3, 很好 2012-09-17 17:21:16
刚开始的时候回收，之后酶切，都没有条带，后来多做几次熟练了就好了。总结几点：1.尽量少切胶，把条带完整切出来。
2.在加洗脱液之前要确保乙醇挥发光，开盖放那静置时间长点。
3.洗脱液用之前要预热，加的时候确保要加到过滤膜上，多洗脱几遍。
之后祝你成功！
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无
12楼2012-09-03 16:02:21
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zhouxiaohan

木虫 (正式写手)
★
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-09-17 17:21:32
估计就是试剂盒到了保质期了。另外，柱子也有时间限制的。柱子过期会对结果影响很大的。我们也是用天根的，效果还可以。
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13楼2012-09-03 16:23:32
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yiyi12

银虫 (小有名气)
★ ★
1949stone: 金币+2, 不错 2012-09-17 17:21:39
可能试剂盒有问题。我之前就遇到过这种情况，试剂盒有问题，半个月徒劳无功。当时是omega的，换了天跟的才继续往下做。建议换下试剂盒，我觉得天跟的胶回收试剂盒还是不错的。中间用漂洗液洗的时候最好静置几分钟再离心。最后一步用水洗脱也先静置几分钟，可以把水60度预热一下。
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14楼2012-09-04 10:29:50
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lma223

铜虫 (正式写手)
★ ★
1949stone: 金币+2, 比较保险 2012-09-17 17:21:55
1）一次多做几个PCR，我一般做5个PCR tube，过柱子合并至一个tube中
2）注意监测是否用了合适的Isopropanol(100%)
3) 检查Extraction buffer 是否过期。
Qiagen column and Kit
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知行合一，致良知！
15楼2012-09-04 10:48:07
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nictkk

新虫 (初入文坛)
楼主哪个大学哪个实验室~  看着好眼熟啊~
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16楼2012-09-16 20:22:04
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ljh122510797

铜虫 (小有名气)
用PH8.0的水，预热到65度洗脱试试。
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17楼2012-09-16 20:37:39
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
1949stone: 找到校友？？ 2012-09-17 17:22:13
引用回帖:
16楼: Originally posted by nictkk at 2012-09-16 20:22:04
楼主哪个大学哪个实验室~  看着好眼熟啊~

湖南农大！！！
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18楼2012-09-17 12:31:38
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by ljh122510797 at 2012-09-16 20:37:39
用PH8.0的水，预热到65度洗脱试试。

谢谢，我试一试吧！
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19楼2012-09-17 12:32:01
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone: 回帖置顶 2012-09-17 17:19:48
1949stone: MolEPI+1, very good 2012-09-17 17:20:12
个人见解，胶回收重要点：

电泳要让目的条带与杂带分开，以防污染；电泳液最好换新的。切胶要完全。
溶胶58度，10分钟，期间混匀3次，保证充分融化。

冰浴约5分钟（此步非常重要，一般试剂盒中都说是冷却至室温，但是温度越低与柱子结合效率越高。不管是质粒提取试剂盒还是胶回收，包括后面的洗脱EB预热是一个道理，温度高柱子结合效率低，温度低结合效率高。所以试剂盒的保存条件是不高于35度，高温保质期短）

冰浴后上柱离心按步骤来。空甩后注意让乙醇挥发完全，直接用鼻子闻下即可，看是否有乙醇味道。
加洗脱液EB，60度放置2-3分钟后高速离心1次即可。
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20楼2012-09-17 16:27:40
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