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sweetjuan

木虫 (小有名气)

[求助] 求助，PCR技术指导

菌液PCR可以扩出来，而且目的条带很单一，但是测序结果却是空载，哪一位可以解释一下吗？我该怎么办？谢谢！
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1楼 2012-08-30 15:05:12
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是菌落PCR还是菌液？是菌落的话可能挑到平板上的未连接的片段了。如果是菌液，就抽个质粒再做一下鉴定好了。
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2楼2012-08-30 15:59:51
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sweetjuan

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-30 15:59:51
是菌落PCR还是菌液？是菌落的话可能挑到平板上的未连接的片段了。如果是菌液，就抽个质粒再做一下鉴定好了。

好的，我再试试看！3Q！
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3楼2012-08-31 17:16:05
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sweetjuan

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-30 15:59:51
是菌落PCR还是菌液？是菌落的话可能挑到平板上的未连接的片段了。如果是菌液，就抽个质粒再做一下鉴定好了。

质粒为模板，PCR结果仍然为单一的目的条带，但是做双酶切时候总是切不开，酶没有问题，但是测序结果仍然为空载体。我不知道为什么？
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4楼2012-09-02 20:28:36
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sweetjuan at 2012-09-02 20:28:36
质粒为模板，PCR结果仍然为单一的目的条带，但是做双酶切时候总是切不开，酶没有问题，但是测序结果仍然为空载体。我不知道为什么？...

能够给我一点更详细的信息吗？比如说什么载体？什么酶？目的基因的来源，菌落PCR引物等。
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5楼2012-09-02 21:29:35
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sweetjuan

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-09-02 21:29:35
能够给我一点更详细的信息吗？比如说什么载体？什么酶？目的基因的来源，菌落PCR引物等。...

PCMV-N-flag载体，EcoRI 和Xho I 目的基因来源于狂犬病毒的蛋白基因
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6楼2012-09-03 14:37:57
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by sweetjuan at 2012-09-03 14:37:57
PCMV-N-flag载体，EcoRI 和Xho I 目的基因来源于狂犬病毒的蛋白基因...

既然测序都是空载了，那就只能重新做了。菌落PCR时选择一条来自载体，一条来自目的基因的引物，这样出现假阳性的几率会很小，基本能排除了！
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7楼2012-09-03 18:38:08
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