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傻饭

新虫 (初入文坛)

[交流] western blot 已有4人参与

SDS-PAGE能够跑出目的条带，可western blot却跑不出目的条带，恳请各位前辈指点迷津。万分感激。
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傻并快乐着
1楼 2012-08-28 11:58:29
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tanglian8655

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这个问题问的有点笼统哦
需要摸索反应条件，分析你的蛋白是否转到膜上了，抗体的特异性是否良好等
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2楼2012-08-28 13:13:26
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lidonghong

金虫 (正式写手)
★
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是啊 ，你的问题太模糊了 ，说的可以再仔细点不咯！！
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生物化学与分子生物学
3楼2012-08-28 17:00:37
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jl860822

金虫 (正式写手)
把你的实验条件讲一下，这样才能具体分析
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4楼2012-08-29 08:37:23
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linatracy

金虫 (小有名气)
★
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WB反应是很灵敏的，量很少就可以有反应，在确保实验操作全部正确的情况下，有可能你的目的蛋白没有反应活性。
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5楼2012-08-29 17:44:05
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傻饭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tanglian8655 at 2012-08-28 13:13:26
你这个问题问的有点笼统哦
需要摸索反应条件，分析你的蛋白是否转到膜上了，抗体的特异性是否良好等

转膜的时间、电流；一二抗的浓度都摸索了。依旧不行。
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傻并快乐着
6楼2012-09-06 20:51:21
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傻饭

新虫 (初入文坛)
我在做原核表达的时候，分别从IPTG浓度、时间、温度三方面对表达条件进行了优化，SDS检测，通过分子量及蛋白表达量的变化确定我的目的蛋白正确。但做到WB的时候，我的目的蛋白无论如何也转不到膜上。膜上出来的条带都是杂带，没有我的目的带。
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傻并快乐着
7楼2012-09-06 20:55:52
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傻饭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linatracy at 2012-08-29 17:44:05
WB反应是很灵敏的，量很少就可以有反应，在确保实验操作全部正确的情况下，有可能你的目的蛋白没有反应活性。

我的是跨膜蛋白，有信号肽，扩膜结构。是否这些对表达有影响？
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傻并快乐着
8楼2012-09-06 20:56:56
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傻饭

新虫 (初入文坛)
说的再直接一点就是：SDS的时候有目的带，大小为55.但WB的时候，55带没有，只有55以下的带。但marker170的带都有，所以我排除了转膜时间过短的问题。
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傻并快乐着
9楼2012-09-06 20:59:13
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tanglian8655

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 傻饭 at 2012-09-06 20:51:21
转膜的时间、电流；一二抗的浓度都摸索了。依旧不行。...

那你的抗原和抗体呢？
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10楼2012-09-06 21:30:03
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