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遇见林

铁虫 (初入文坛)


[交流] DGGE条带分不开

最近做DGGE老是出现如下状况请各位同行帮忙分析下:
实验条件:用的是Bio-Rad475型梯度混合装置。做的是污水生物处理过程污泥中 亚硝酸盐氧化菌(Nosz),引物F968,R1401,约430bp。
图一:胶浓度8%,变性剂浓度范围是30%-50%,电泳温度60°C。电压120V,电泳7小时。TEMED20微升,100微升10%的APS。
图二:胶浓度6%,变性剂浓度范围是35%-45%,电泳温度60°C。电压70V,电泳14小时。TEMED20微升,100微升10%的APS。
附图三是P出的结果,感觉不是PCR的问题。PCR是50微升体系,引物2微升,模板5微升,mastermix25微升,加水补齐。
请各位大侠找找问题出在哪儿????谢谢啦。。。

图一



图二


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ygbxk

铁杆木虫 (正式写手)


你可以做一个总细菌的引物看看,如果没问题就是引物的问题了,还有问题就是电泳的问题了。可能性挺多,如果你用的药品时间较长或者被冰冻过,可能也出现这种情况,其它原因就不好说了,可能你得慢慢摸索。另外反硝化的引物有好多,你可以再查查问问试试。
6楼2012-08-26 16:23:17
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userhung

禁虫 (文学泰斗)


★ ★ ★
遇见林(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+2, 谢谢提供链接 2012-08-27 00:54:28
2楼2012-08-26 11:02:30
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ygbxk

铁杆木虫 (正式写手)


★ ★ ★
遇见林(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-08-27 00:54:49
很有可能是引物的问题,DGGE原则上只能区分500个bp以下的DNA片段,你的引物对的扩增范围有点大,快接近500bp了。
5楼2012-08-26 16:18:09
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遇见林

铁虫 (初入文坛)


引用回帖:
6楼: Originally posted by ygbxk at 2012-08-26 16:23:17
你可以做一个总细菌的引物看看,如果没问题就是引物的问题了,还有问题就是电泳的问题了。可能性挺多,如果你用的药品时间较长或者被冰冻过,可能也出现这种情况,其它原因就不好说了,可能你得慢慢摸索。另外反硝化 ...

我们的药品都是放四度冰箱里的。。O(∩_∩)O谢谢。。
7楼2012-08-26 16:50:59
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liufuliang12楼
2012-08-27 08:49   回复  
遇见林(金币+1): 谢谢参与
假大空13楼
2012-08-27 09:48   回复  
遇见林(金币+1): 谢谢参与
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