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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DGGE条带分不开
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遇见林

铁虫 (初入文坛)

[交流] DGGE条带分不开

最近做DGGE老是出现如下状况请各位同行帮忙分析下：
实验条件：用的是Bio-Rad475型梯度混合装置。做的是污水生物处理过程污泥中 亚硝酸盐氧化菌（Nosz），引物F968，R1401，约430bp。
图一：胶浓度8%，变性剂浓度范围是30%-50%，电泳温度60°C。电压120V，电泳7小时。TEMED20微升，100微升10%的APS。
图二：胶浓度6%，变性剂浓度范围是35%-45%，电泳温度60°C。电压70V，电泳14小时。TEMED20微升，100微升10%的APS。
附图三是P出的结果，感觉不是PCR的问题。PCR是50微升体系，引物2微升，模板5微升，mastermix25微升，加水补齐。
请各位大侠找找问题出在哪儿？？？？谢谢啦。。。

图一



图二
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1楼 2012-08-26 10:20:41
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ygbxk

铁杆木虫 (正式写手)
★
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-09-02 07:33:48
引用回帖:
10楼: Originally posted by 遇见林 at 2012-08-27 08:43:35
你的意思是范围有点儿大，算下来也就430bp( ⊙ o ⊙ )！。。...

你看到文献当中有用这个引物做DGGE的吗？有的话应该没问题，没有的话就不好说了。
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14楼2012-08-27 11:18:19
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★ ★ ★
遇见林(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+2, 谢谢提供链接 2012-08-27 00:54:28
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=1495840
http://bbs.bbioo.com/forum.php?mod=viewthread&tid=50983
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2楼2012-08-26 11:02:30
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ygbxk

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
遇见林(金币+1): 谢谢参与
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2012-08-27 00:54:49
很有可能是引物的问题，DGGE原则上只能区分500个bp以下的DNA片段，你的引物对的扩增范围有点大，快接近500bp了。
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5楼2012-08-26 16:18:09
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ygbxk

铁杆木虫 (正式写手)
你可以做一个总细菌的引物看看，如果没问题就是引物的问题了，还有问题就是电泳的问题了。可能性挺多，如果你用的药品时间较长或者被冰冻过，可能也出现这种情况，其它原因就不好说了，可能你得慢慢摸索。另外反硝化的引物有好多，你可以再查查问问试试。
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6楼2012-08-26 16:23:17
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liufuliang12楼
2012-08-27 08:49   回复  
遇见林(金币+1): 谢谢参与
假大空13楼
2012-08-27 09:48   回复  
遇见林(金币+1): 谢谢参与
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