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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 包涵体 复性
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consist10

金虫 (正式写手)

[求助] 包涵体 复性

请教亲们一个问题：包涵体变性复性后为什么挂GST柱子时蛋白就析出了呢？
变性液：8M尿素，
复性：4度透析复性 8M-6M-4M-2M-1M-0.5M尿素-PBS，复性液中含有L-精氨酸，氧化型和还原型谷胱甘肽。
为什么进行GST纯化挂柱时蛋白就析出来了呢？
急求 请教亲们 有金币答谢
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1楼 2012-08-21 13:42:11
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白析出？沉淀吧。
上柱之前没有变化吗？
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consist10
2楼2012-08-21 14:32:39
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consist10

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-21 14:32:39
蛋白析出？沉淀吧。
上柱之前没有变化吗？

是啊 上柱子之前没有沉淀啊 愁人呢
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3楼2012-08-21 15:45:36
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
consist10: 金币+5 2012-08-21 19:04:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by consist10 at 2012-08-21 15:45:36
是啊 上柱子之前没有沉淀啊 愁人呢...

你的GST柱子上样之前，用buffer平衡了吗？
还有，温度是和透析之后温度一样吗？
你的沉淀是洗脱时候沉淀的吧？洗脱的buffer pH是要和上样一样的哦，不然就沉淀了。
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4楼2012-08-21 16:26:38
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consist10

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-21 16:26:38
你的GST柱子上样之前，用buffer平衡了吗？
还有，温度是和透析之后温度一样吗？
你的沉淀是洗脱时候沉淀的吧？洗脱的buffer pH是要和上样一样的哦，不然就沉淀了。...

上柱子前平衡了，温度是室温，透析时温度是4度，这个影响大吗？我说的沉淀是上样的时候在柱子里就沉淀了，从而未挂到柱子上，还没做到洗脱那一步的。看来您很懂这方面，多请教您了。还有您做过GST纯化时，分子伴侣GroEL的去除吗？谢谢啦。
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5楼2012-08-21 19:03:59
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
consist10: 金币+3, ★有帮助 2012-08-22 09:40:17
引用回帖:
5楼: Originally posted by consist10 at 2012-08-21 19:03:59
上柱子前平衡了，温度是室温，透析时温度是4度，这个影响大吗？我说的沉淀是上样的时候在柱子里就沉淀了，从而未挂到柱子上，还没做到洗脱那一步的。看来您很懂这方面，多请教您了。还有您做过GST纯化时，分子伴侣 ...

看你的描述，柱子可能有变性剂没洗掉，洗彻底再平衡。
温度的原因。我觉得蛋白是要温柔对待的，特别是变复性之后的，呵呵，你可以用在冰上预冷的buffer去平衡柱子，最好能在4℃冰库或者血液冷藏箱里操作。
分子伴侣说实话了解不多，不过分子伴侣是在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，所以，我觉得没必要去掉。
多交流啊。
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6楼2012-08-22 08:45:16
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consist10

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-22 08:45:16
看你的描述，柱子可能有变性剂没洗掉，洗彻底再平衡。
温度的原因。我觉得蛋白是要温柔对待的，特别是变复性之后的，呵呵，你可以用在冰上预冷的buffer去平衡柱子，最好能在4℃冰库或者血液冷藏箱里操作。
分子伴 ...

柱子可能是没洗干净，值得考虑的建议。我们科室没有4度冰库或冷藏箱，所以很难维持低温的环境。分子伴侣是我在做蛋白可溶性蛋白GST纯化时出现的，为了蛋白的纯度，必须除去和融合蛋白结合在一起的分子伴侣，呵呵，实在不行，就考虑换表达载体了，不过，O(∩_∩)O谢谢！请问您有包涵体纯化的步骤吗？参考别人做的，看自己问题在哪里。
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7楼2012-08-22 09:43:45
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by consist10 at 2012-08-22 09:43:45
柱子可能是没洗干净，值得考虑的建议。我们科室没有4度冰库或冷藏箱，所以很难维持低温的环境。分子伴侣是我在做蛋白可溶性蛋白GST纯化时出现的，为了蛋白的纯度，必须除去和融合蛋白结合在一起的分子伴侣，呵呵， ...

其实我觉得你试试换个HIS标签，毕竟gst标签容易表达时候形成标签二聚体，后续处理很麻烦。
包涵体纯化，我没有具体步骤，我最近做的一个EK酶的纯化步骤，文献给你发过去，你参考下，但是活性不高，沉淀倒是没有。
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8楼2012-08-22 11:19:41
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
consist10: 金币+6, ★★★很有帮助, 多谢您了 2012-08-24 09:15:37
文献
Purification and refolding optimization of recombinant bovine enterokinase light.pdf
http://kuai.xunlei.com/d/GAVYCJCTOBJF?p=130497
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9楼2012-08-22 11:21:39
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