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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 对于一个没有内含子的基因，请问用基因组或cDNA作为模板跑PCR对于结果有什么影响吗？
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sherrysure

银虫 (小有名气)

[求助] 对于一个没有内含子的基因，请问用基因组或cDNA作为模板跑PCR对于结果有什么影响吗？

请问大家，
对于一个没有内含子的基因，用基因组或cDNA作为模板跑PCR对于结果有什么影响吗？
我在扩一个基因，用公布的mRNA序列设计的引物，文献上都是用反转录后的cDNA跑的PCR，但是我将这一序列到我所做的生物基因组中比对后发现其没有内含子，所以我就用它的基因组试着跑PCR，可是没有条带，不知道是什么原因。
还希望高手不吝赐教。

另外还想请问一下：
跑PCR的时候，什么时候用rTaq酶，什么时候用LA Taq酶？
两者PCR对后续实验又影响吗？

万分感激！
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1楼 2012-08-16 17:07:26
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674515734

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来生物医药区发帖贡献。 2012-08-16 20:16:56
基因与mRNA反转录到的DNA是不一样的，基因即使没有内含子，也会有基因转录的调控序列等，要比mRNA反转录得到的序列长，此外，初级转录产物还可能会被间接修饰等。所以不能用基因序列代替cDNA。
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sherrysure
在卑微中活出精彩，在短暂中寻求永恒。。。
2楼2012-08-16 17:45:56
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sherrysure

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 674515734 at 2012-08-16 17:45:56
基因与mRNA反转录到的DNA是不一样的，基因即使没有内含子，也会有基因转录的调控序列等，要比mRNA反转录得到的序列长，此外，初级转录产物还可能会被间接修饰等。所以不能用基因序列代替cDNA。

你好，谢谢你的解答，但是我没有看的很明白。

还想请问一下，引物序列不是已经把扩增出来的序列长度给框定了吗？为什么调控序列也会同时扩增出来呢？
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3楼2012-08-21 09:01:12
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liuwt2008

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果没有内含子的话，用基因组扩增，应该没问题的。如没有条带，有没有试着优化反应体系。
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4楼2012-08-21 09:32:58
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuwt2008 at 2012-08-21 09:32:58
如果没有内含子的话，用基因组扩增，应该没问题的。如没有条带，有没有试着优化反应体系。

已经调整了很多次退火温度，也尝试用巢式PCR扩增，已经摸索了半个月，一直没有结果，不知道是什么原因。
引物也是按照文献上设计的，比文献多2个碱基或者比文献少3个碱基都没法扩出来，应该不会是引物问题吧？
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5楼2012-08-21 13:10:04
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liuwt2008

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

问一下，你的材料跟文献中的材料一样吗，如果不一样，他们的分类关系近吗？
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6楼2012-08-21 17:22:11
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liuwt2008

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果还是扩不出来，模板也有可能存在问题。建议测一下模板质量。
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7楼2012-08-21 17:25:34
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuwt2008 at 2012-08-21 17:25:34
如果还是扩不出来，模板也有可能存在问题。建议测一下模板质量。

模板应该是没有问题的，因为之前怀疑可能模板有问题，试着扩了以前扩出来过的基因成功过，所以不知道这次是哪里有问题呢。

对了，两个种之间亲缘关系是比较近的，扩比较保守的基因，他们只差十几二十个碱基。
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8楼2012-08-21 22:05:39
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liuwt2008

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助，七夕快乐 2012-08-23 15:47:52
模板、引物、体系都试探过，但没扩出来。那就有点复杂了。（扩了以前扩出来过的基因成功过，并不代表模板一点问题也没有。是不是扩出来的基因片段要比没扩出来的小？如果真是这样，不过个人认为模板的问题大一些。）
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9楼2012-08-23 09:17:49
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sherrysure

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by liuwt2008 at 2012-08-23 09:17:49
模板、引物、体系都试探过，但没扩出来。那就有点复杂了。（扩了以前扩出来过的基因成功过，并不代表模板一点问题也没有。是不是扩出来的基因片段要比没扩出来的小？如果真是这样，不过个人认为模板的问题大一些。）

确实是的呢，之前扩出来过的基因大小是800左右，现在正在扩的却没扩出来的大约1400。为什么这样就可以认为是模板问题呢？
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10楼2012-08-23 09:39:29
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