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喝啥别喝三鹿，学啥别学生物

1楼2012-08-01 16:57:33

77638333

金虫 (著名写手)

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引用回帖:

7楼: Originally posted by tiani_tan at 2012-08-03 13:10:11
根据你做qPCR采用的方法。染料法必须做融解曲线，主要是看的PCr产物是否特异，或者跑胶看看是否是特异扩增；如果用探针法或分子信标法的话，就不用了。

用的是TaqMAN探针，那不用了？呵呵。

喝啥别喝三鹿，学啥别学生物

8楼2012-08-03 13:34:55

查看全部 8 个回答

chenguestc

木虫 (职业作家)

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★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
77638333: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢。qPCR参数已经有了。融解曲线的protocols能否详细一些？ 2012-08-01 22:25:14
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极热心的帮忙解答问题 2012-08-02 15:29:35

是的。溶解曲线是必须做的。
我们常用到的qPCR supplies 及用量（1个反应，20ul体系）如下，楼主可根据这个用量适量调整：
TBSYBRmix                10 ul
PrimerF (10uM)          0.6 ul
PrimerFR (10uM)       0.6 ul
cDNA (20ng/ul)          2 ul
Reference dye          0.4 ul
ddH2O                      6.4 ul

PCR条件：
95度 1min
40x  95度 15s
   60度 45s
最后，melt curve
   95度 15s
   60度 45s
      95度 15s
可适当调整。

2楼2012-08-01 22:10:17

chenguestc

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★
77638333: 金币+1, ★有帮助, 谢谢! 2012-08-02 17:02:29

95度 15s
60度 45s
95度 15s
这个就是溶解曲线的PROTOCOL啊，当你的反应完成后，最后用上述步骤来考量是否你的所有PCR产物的TM值一致，如果一致，再检查反应效率等指标。如果不一致则需要调整条件或者换引物。

3楼2012-08-02 07:47:42

lixc2009

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-02 15:29:49
77638333: 金币+1, ★有帮助, 谢谢啦 2012-08-02 17:04:15

溶解曲线只是PCR仪的其中之一的功能，我在做PCR时有的会用到，有的不需要做，看你做什么实验。分享下我的PROTOCOLS:
预变性：  95℃ 5min    *1
PCR ：  95℃ 10s
            60℃ 15s    *50
            72℃ 25s
HRM ：  95℃ 1min
            40℃ 1min    *1
            65℃ 1s
            95℃ 检测荧光
COOLING: 40℃    10S
希望对你有帮助！！

广州珈源--肿瘤检测、安博抗体，欢迎您！！

4楼2012-08-02 09:37:38