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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问Real time q PCR一定要做融解曲线吗？
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77638333

金虫 (著名写手)

[求助] 请问Real time q PCR一定要做融解曲线吗？

有没有具体的protocol？谢谢
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喝啥别喝三鹿，学啥别学生物
1楼 2012-08-01 16:57:33
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77638333

金虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tiani_tan at 2012-08-03 13:10:11
根据你做qPCR采用的方法。染料法必须做融解曲线，主要是看的PCr产物是否特异，或者跑胶看看是否是特异扩增；如果用探针法或分子信标法的话，就不用了。

用的是TaqMAN探针，那不用了？呵呵。
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喝啥别喝三鹿，学啥别学生物
8楼2012-08-03 13:34:55
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查看全部 8 个回答

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
77638333: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢。qPCR参数已经有了。融解曲线的protocols能否详细一些？ 2012-08-01 22:25:14
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极热心的帮忙解答问题 2012-08-02 15:29:35
是的。溶解曲线是必须做的。
我们常用到的qPCR supplies 及用量（1个反应，20ul体系）如下，楼主可根据这个用量适量调整：
TBSYBRmix                 10 ul
PrimerF (10uM)           0.6 ul
PrimerFR (10uM)         0.6 ul
cDNA (20ng/ul)           2 ul
Reference dye             0.4 ul
ddH2O                        6.4 ul

PCR条件：
95度 1min
40x  95度 15s
       60度 45s
最后，melt curve
       95度 15s
       60度 45s
        95度 15s
可适当调整。
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2楼2012-08-01 22:10:17
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
77638333: 金币+1, ★有帮助, 谢谢! 2012-08-02 17:02:29
95度 15s
        60度 45s
         95度 15s
这个就是溶解曲线的PROTOCOL啊，当你的反应完成后，最后用上述步骤来考量是否你的所有PCR产物的TM值一致，如果一致，再检查反应效率等指标。如果不一致则需要调整条件或者换引物。
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3楼2012-08-02 07:47:42
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lixc2009

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-02 15:29:49
77638333: 金币+1, ★有帮助, 谢谢啦 2012-08-02 17:04:15
溶解曲线只是PCR仪的其中之一的功能，我在做PCR时有的会用到，有的不需要做，看你做什么实验。分享下我的PROTOCOLS:
预变性：  95℃    5min     *1
PCR    ：  95℃    10s      
               60℃    15s      *50
               72℃    25s
HRM   ：  95℃   1min
               40℃   1min      *1
               65℃    1s
               95℃    检测荧光
COOLING:    40℃     10S
希望对你有帮助！！
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广州珈源--肿瘤检测、安博抗体，欢迎您！！
4楼2012-08-02 09:37:38
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